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研究背景与目的恶性肿瘤以高发病率,高致死率及预后差的特点严重威胁人类的生命健康,是人类面临的重要公共卫生问题之一。运动训练可以降低多种癌症的发生和死亡率,但是运动干预肝癌的机制仍尚未明确。本课题组前期的研究证实,预运动训练能够提升在体NK细胞的含量和杀伤作用,可能通过促进肿瘤细胞的凋亡在干预肿瘤发病中发挥作用(待发表)。骨骼肌作为人体重要的内分泌器官,运动后可大量合成和分泌IL-15。IL-15在肿瘤免疫疗法中可通过诱导NK细胞的增殖分化与增强NK细胞杀伤作用发挥抗肿瘤作用,提示我们IL-15可能在抗肿瘤方面发挥重要作用。为探究IL-15在预运动训练干预小鼠肝肿瘤发病中的作用机制,本研究先采用一次性运动血清孵育肝癌细胞模型验证NK细胞在预运动训练干预小鼠肝肿瘤发病的机制,然后用预运动的动物模型探究癌旁组织中IL-15相关蛋白信号通路在预运动训练干预小鼠肝癌发病的机制的作用机制。第一部分一次性运动小鼠的血清对孵育肝癌细胞活性的抑制作用材料与方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:安静+注射PBS组(C组)、一次性运动+注射PBS组(A组)、安静+注射IL-15组(I组)和一次性运动+注射IL-15组(IA组)。注射用PBS为200μL,IL-15为以200μLPBS溶解,37℃孵育1小时的4.5μgIL-15+15μgIL-15Rα-FC溶液,一次性运动为12m/min×1h的跑台运动。以TUNEL测定小鼠肝脏细胞凋亡情况,以ELISA法测定血清中IL-15、INF-γ和TNF-α含量,以流式细胞技术检测血清中NK细胞数量。取各组小鼠血清对Hepa1-6细胞进行孵育,每组血清进行两种处理,一为直接孵育,二为孵育时加入肾上腺素阻断剂ProPranolol,对照为空白培养基孵育,48小时后用CCK-8测定细胞活性。运用SPSS 26.0软件进行统计学分析,以双因素方差分析比较组间差异。研究结果:1.TUNEL检测各组凋亡情况与C组小鼠相比,A组小鼠IHS明显下降(p<0.05),I组小鼠IHS极明显下降(p<0.01),而运动与IL-15注射联用的IA组的HIS则比A组和I组更低。2.小鼠血清孵育及与ProPranolol共孵育时Hepa1-6细胞的活性变化与正常胎牛血清培养基培养的细胞相比,采用小鼠血清配制的培养基孵育的细胞活性没有显著差异。以A组和IA组小鼠血清孵育Hepa1-6细胞,不加ProPranolol时的细胞活力比加入ProPranolol时的细胞活力显著降低(p<0.05);无论是否加入ProPranolol,A组血清孵育的Hepa1-6细胞活力显著低于C组血清孵育效果(p<0.01),IA组血清孵育的Hepa1-6细胞活力显著低于I组血清孵育效果(p<0.01)。3.各组血清中IL-15、INFγ和TNF-α水平与C组小鼠相比,A组和I组小鼠的血清IL-15显著增高(p<0.05),INF-γ和TNF-α含量极显著升高(p<0.01);与A小鼠相比,IA组小鼠血清IL-15、INF-γ、TNF-α含量均极显著升高(p<0.01);与I组小鼠相比,IA组小鼠血清IL-15和INF-γ含量极显著升高(p<0.01),TNF-α含量显著升高(p<0.05)。4.流式细胞技术检测各组小鼠血清中的NK细胞比例与C组小鼠相比,无论是一次性运动还是注射IL-15,血清中NK细胞比例均可明显升高(p<0.05),而运动与注射IL-5联合干预(IA组)的NK细胞比例要比单纯运动(A组)和单纯注射IL-5(I组)均进一步增高(p<0.01)。第二部分采用预运动训练模型研究IL-15在小鼠肝癌发病中的作用机制材料与方法:选取7月龄雄性C57BL/6小鼠24只,随机分为对照组(C)和运动组(E)。运动组进行12周速度为12m/min的中等强度跑台训练,C组正常饲养12周。12周后,将C组和E组各随机抽取一半小鼠,向腹腔肝脏原位注射100μLHepa1-6细胞悬液(含2×10~6cell),以制备肿瘤模型,命名为安静肿瘤组(CP)和运动肿瘤组(EP)。肿瘤模型构建期间所有小鼠均不运动。注射13天后取小鼠肝脏进行如下检测:观察小鼠肝脏形态;TUNEL法检测小鼠肝脏凋亡情况;蛋白印迹法检测IL-15相关蛋白信号通路各蛋白变化情况,包括P-AMPK、AMPK、SIRT1、IL-15、ACP53、P53、Caspase9、Caspase3。运用SPSS 26.0软件进行统计学分析,双因素方差分析比较组间差异,p<0.05判为具有显著差异性。研究结果:1.各组小鼠肝脏形态变化情况与正常小鼠相比,肿瘤小鼠肝脏体积增大,肝叶组织变硬,肝叶变脆,排列松散;预运动小鼠肝脏肿瘤比安静小鼠肝脏肿瘤积缩小,硬块组织量相对较少。2.各组小鼠癌旁组织凋亡情况与正常安静组小鼠相比,运动组小鼠肝脏IHS显著降低(p<0.01),安静小鼠癌旁组织IHS显著降低(p<0.01);预运动的小鼠肝癌旁组织比安静小鼠肝癌旁组织IHS显著降低(p<0.01)。3.各组小鼠肝癌旁组织IL-15相关蛋白信号通路蛋白变化情况与正常安静小鼠肝脏组织相比,运动组小鼠肝脏P-AMPK/AMPK的比值及SIRT1蛋白表达量显著升高,ACP53/P53的比值、Caspase9蛋白表达量和Caspase3蛋白表达量显著降低;与正常安静小鼠肝脏组织相比,安静小鼠癌旁组织中P-AMPK/AMPK的比值显著降低,SIRT1蛋白表达量显著升高,ACP53/P53的比值、Caspase9蛋白表达量和Caspase3蛋白表达量显著降低;与安静小鼠肝癌旁组织相比,预运动的小鼠肝癌旁组织P-AMPK/AMPK的比值和SIRT1蛋白表达量显著升高,ACP53/P53比值、Caspase9蛋白表达量及Caspase3蛋白表达量显著降低。4.IL-15mRNA的表达变化情况与正常安静小鼠相比,运动组小鼠肝脏IL-15mRNA表达显著升高(p<0.05),安静小鼠肝癌旁组织中IL-15mRNA表达明显降低(p<0.05)。预运动的小鼠肝癌旁组织比安静小鼠肝癌旁组织IL-15mRNA表达显著升高(p<0.05)。研究结论:1.一次性运动与注射IL-15/IL-15Rα复合物均可使小鼠血清中IL-15水平显著升高,同时增加NK细胞的含量和杀伤作用;运动条件血清可使肝癌细胞活性显著下降。说明预运动干预肿瘤发生发展可能是通过在体IL-15的升高提升了NK细胞的含量和杀伤作用。2.预运动可显著改善肝脏肿瘤的进展,使肝脏癌旁组织凋亡情况显著降低。可能机制为通过干预IL-15相关蛋白信号通路使癌旁组织中产生抗凋亡作用来干预小鼠肝肿瘤的发病。