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溶血性曼氏杆菌是动物上呼吸道中共生的常在菌,当存在环境压力或应激等因素时,大量增殖,引起严重的呼吸道感染,且易与病毒和其他细菌混合感染或继发感染。目前,在一些集约牛场中普遍存在,导致重要的经济损失。国外主要采用多价或多联灭活疫苗进行免疫,效果评价不一。我国尚缺乏预防该病的疫苗。本研究从严重呼吸道症状的发病牛和病死牛肺脏和鼻拭子中分离鉴定获得致病菌株,建立小鼠感染模型,进而研制灭活疫苗,确定其安全性和免疫原性,对于规模化牛场该病的预防具有重要的现实意义。首先无菌采集黑龙江省三地牛场发病牛的肺脏和鼻拭子,经病原分离培养、染色镜检、生化试验、PCR鉴定、血清型和毒力因子检测,确定分离株的生物学特性。以鼻腔、腹腔途径,分别采用不同剂量的分离菌株接种清洁级昆明系小白鼠,确定最佳接种方式和致病性,建立小鼠感染模型。选择制备疫苗的致病菌与攻毒菌株,优化培养基和灭活条件,制备蜂胶佐剂、铝佐剂、206佐剂灭活疫苗。小鼠间隔三周皮下接种疫苗2次,通过攻毒试验、ELISA抗体检测、细胞因子QRT-PCR检测等方法确定疫苗的安全性和免疫效力。本研究成功分离鉴定三株有较强致病性的溶血性曼氏杆菌,分别命名为JS0165、LY02、WC16493株。通过对其表型以及生化鉴定表明分离菌株与溶血性曼氏杆菌特性相符,进一步应用PCR扩增16S rDNA基因,序列分析表明其与溶血性曼氏杆菌同源性达99%以上。经多重PCR鉴定生物型为A6型2株（JS0165、LY02）,A1型1株（WC16493）。9种主要毒力因子（plpE、lktA、lktC、ompA、gs60、gcp、adh、tbpB、nmaA）全部被检出,药敏试验结果表明该菌对阿米卡星最敏感。分离菌株对昆明小鼠的LD50分别为JS0165=7.94×107 CFU/mL,LY02=1.9×107 CFU/m L,WC16493=9.91×108 CFU/m L。攻毒死亡小鼠病理组织学观察可见肺脏的肺泡腔消失,有大量炎性渗出液,黏膜上皮细胞变性坏死等病理学特征。筛选确定BHI为适宜的增菌培养基。灭活条件为终浓度0.1%的甲醛溶液（v/v）灭活6 h,最佳免疫剂量为109 CFU/只。疫苗免疫攻毒试验结果表明,对同生物型致病菌攻毒保护率为70%-75%,异型致病菌攻毒保护率为40%-50%。小鼠与牛免疫后可产生特异性抗体,免疫小鼠血液中细胞因子IL-4、IFN-γ、TNF-α水平与对照组相比表达显著。综上所述,本研究应用PCR技术确定了牛溶血性曼氏杆菌分离株的生物型,成功建立了小鼠感染模型。研制的灭活疫苗免疫小白鼠可对同生物型强毒菌株感染产生一定的保护作用。本研究为我国牛溶血性曼氏杆菌病的预防提供了可靠方法和科学指导。