研究背景肌腱病（tendinopathy）不但是一种职业病，也是最常见的运动损伤性疾病，发病率高，是目前骨科学和运动医学主要的伤病之一。大量研究表明：过度牵伸载荷导致肌腱的微损伤及不成熟的修复是其发生的直接原因，病理表现为腱变性、细胞外基质增加、胶原排列紊乱、肌腱内血管不规则增生、钙化、骨化及止点唇样增生。众所周知人体各种形式的运动都是由肌肉收缩通过肌腱、韧带带动骨、关节运动而实现的，肌腱在体内不断承受各种动态的力学刺激，力学刺激可引起肌腱结构的重塑和细胞生物学行为的改变，最终导致肌腱生理或者病理变化，在力学刺激的传递、转化过程中，各种信号分子发挥着重要作用，其中钙离子作为第二信使，能将机械信号转化为细胞内生物化学信号引起一系列的生理或者病理过程，同时细胞骨架也是力学传递、信号转导的重要结构，因此，对肌腱细胞内钙离子及细胞骨架在响应力学刺激时的作用及机制研究，已经成为当前运动医学、骨科学的热点。我们假设：过度的机械载荷能导致细胞内钙超载和造成细胞骨架的损伤，激活细胞膜上的钙通道，诱导细胞外钙内流和细胞内钙浓度增加，使细胞内钙超载，最终导致肌腱内钙盐沉积，使肌腱发生钙化。我们前期已成功分离了人肌腱细胞，建立了肌腱细胞体外牵拉模型，本实验拟应用肌腱细胞体外牵拉模型，采用不同的钙通道抑制剂及外源性钙对人肌腱细胞进行干预，利用免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜对比观察过度牵伸载荷与非过度载荷条件下细胞内钙超载及细胞骨架F-actin的变化情况，验证过度牵伸载荷能否诱导体外人肌腱细胞内钙超载及细胞骨架损伤，为肌腱病的发病机制提供理论依据。研究目的模拟体内肌腱细胞平行排列方式及受力情况，应用肌腱细胞体外循环过度牵拉模型，结合免疫荧光技术及激光共聚焦显微镜观察体外人肌腱细胞内钙离子、细胞骨架在过度牵伸条件下的变化，初步探讨Ca2+超载、细胞骨架损伤在过度牵伸载荷所致肌腱病中的作用及细胞内钙超载的机制，阐明肌腱病的可能发生机制，为进一步防治肌腱病提供新思路。方法一、人肌腱细胞的分离培养鉴定及牵拉有效性评价1.人肌腱细胞分离、原代培养及鉴定采用酶消化法在无菌条件下取手术中废弃的肌腱组织进行细胞分离及原代培养，取第二代细胞采用免疫荧光染色—激光共聚焦显微镜技术观察I、III型胶原和波形蛋白（Vimentin）表达情况，进行细胞表型鉴定。2．人肌腱细胞牵拉有效性评价设置牵伸频率1.0Hz；强度4%、8%、12%；时间12h；以同等条件下未牵拉细胞为对照组，不施加应力。分别应用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜、倒置光显微镜观察微沟槽硅树脂培养皿上的细胞形态，对比牵伸组与非牵伸组细胞在微沟槽硅树脂培养皿上是否脱落，漂浮及其排列方式。二、不同牵伸载荷诱导体外人肌腱细胞Ca2+超载及其机制1.不同牵伸载荷诱导细胞内钙超载的免疫荧光分析设置牵伸频率：0.5Hz；牵伸强度分别为：4%、8%、12%；牵伸时间分别为：4、8、12h；共分12组。同时，以同等条件下的细胞设置为对照组，不施加应力。各实验组细胞牵伸结束后采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜进行图像采集，每组取100个细胞计算其荧光强度,并取其均值以平均荧光强度反映细胞内钙离子[Ca2+]i的相对水平。2.细胞外钙螯合剂、钙抑制剂对钙超载的影响设置牵伸频率为：0.5Hz；牵伸强度8%；牵伸时间4h，分别以含1mol/L、0.5mol/L的Mncl₂；1mmol/L及0.5mmol/L EGTA（乙二醇双四乙酸）；100ug/L及50ug/L的肝素；20mM及40mM硝苯地平及20uM、40uM及80uM三氟甲基吩噻嗪的培养基对接种于微沟槽硅树脂培养皿上生长24h后的人肌腱细胞进行牵拉，以不添加抑制剂（牵伸条件相同）为对照组，各实验组细胞牵伸结束后采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜采图，每组取50个细胞计算其荧光强度,并取其均值,以平均荧光强度反映肌腱细胞内钙离子[Ca2+] i的相对水平。3.机械牵伸能诱导人肌腱细胞外钙内流分别取3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L含钙培养基3ml加入已在微沟槽硅树脂培养皿上生长24h的人肌腱细胞中，其中，一组置于37℃含5%CO2培养箱中静置培养4h，另一组安装于细胞牵拉系统中，设置牵拉强度为8%;时间：4h；频率0.5Hz进行牵拉，牵拉结束后，各组细胞采用Flou-3/AM钙探针负载，激光共聚焦显微镜采图。三、不同牵伸载荷及钙超载对人肌腱细胞骨架的影响1.循环牵伸载荷可诱导人肌腱细胞骨架F-actin的损伤：将接种于微沟槽硅树脂培养皿上的人肌腱细胞置于37℃含5%CO2培养箱中静置培养24h，设置牵伸强度分别为：4%、8%、12%；时间：4、8、12、24h；频率：0.5Hz、1.0Hz。采用罗丹明标记的鬼笔环肽（Rhodamine-Phalloidin）及DAPI荧光染色，激光共聚焦显微镜进行图像采集，每组随机选取6个细胞计算其荧光强度,并取其均值,以平均荧光强度反映肌腱细胞F-actin的相对荧光水平。2.钙超载对细胞骨架的损伤分别以3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L不同浓度的含钙培养基加入12孔板中，1.0ml/孔；将12孔板置于37℃、含5%CO2培养箱内静置培养4h，然后吸除含钙培养基，采用罗丹明标记的鬼笔环肽（Rhodamine-Phalloidin）及DAPI免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察F-actin荧光强度的变化，并采集图像。四、统计学分析实验所得各组细胞荧光强度值以均值X±S.E表示，采用SPSS13.0统计软件进行one-way ANOVA或two-way ANOVA分析，方差齐性检验后组间两两比较采用Tamhane检验，P <0.05为差异具有统计学意义。结果一、人肌腱细胞具有特殊的表型学特征，在微沟槽硅树脂培养皿上能实现有效牵拉1.第二代人肌腱细胞具有较强的Ⅰ型胶原和波形蛋白免疫荧光染色；Ⅲ型胶原免疫荧光染色为阴性，符合肌腱细胞的表型学特征。2.微沟槽硅树脂培养皿表面的人肌腱细胞沿沟槽方向伸展，呈长梭形，平行排列，与体内肌腱细胞排列方式类似，在1.0Hz,12%牵伸强度下牵拉12h，细胞在培养皿表面贴附良好，无脱落及漂浮，细胞受力方向与应力方向一致，此模型能很好的模拟体内肌腱细胞的排列方式及受力情况，能实现细胞的有效牵拉。二、机械牵伸能诱导肌腱细胞内钙超载1.设定牵伸时间为4h时，牵伸强度从0%（未牵拉组）增加到4%、8%、12%时，细胞内钙离子荧光强度逐渐增强，牵伸强度为12%时与其他组相比达最高（P<0.05）；当牵伸时间为8h时，也观察到类似的结果；当牵伸时间为12h时，牵伸强度从0%（未牵拉组）增加到4%、8%时，细胞内钙离子荧光强度与0%或4%组相比显著增强（P<0.05）；伸强度为12%时与8%组相比，细胞内钙离子荧光强度轻度降低，但无统计学意义（P＞0.05）。同时，细胞内钙离子荧光强度的增加具有时间依赖性，在对照组（0%），时间从4h增加到8h时，细胞内钙离子荧光强度显著增加，而在12h降到了4h的水平（P＞0.05）；在牵伸强度为4%时，也观察到了类似的结果，但在8%牵伸强度时，从4h到8h、12h细胞内钙离子荧光强度的增加具有显著的时间依赖性。在12%牵伸强度时，每个时间点之间没有明显的差异（P＞0.05）。采用Two-way ANOVA对所测细胞内钙离子荧光值进行数据分析，结果：牵伸强度与持续时间以及它们的交互作用对细胞内钙离子浓度有显著影响（P=0.000<0.01）。牵伸强度的影响大于牵伸时间及两者之间的交互作用。2．细胞内钙超载能被细胞外钙螯合剂、钙通道抑制剂抑制①EGTA为钙离子螯合剂，它能螯合细胞外钙离子，降低细胞基质中的钙浓度，本实验在设定牵伸强度8%；频率0.5Hz；时间4h的条件下分别应用含0.5mmol/L及1mmol/LEGTA处理细胞后，与对照组（牵拉参数相同，但未经EGA处理）相比，随着EGTA浓度的升高，细胞内钙离子荧光强度明显降低，具有明显的剂量依赖性，在1mmol/L时显著降低，One-way ANOVA和Tamhane检验，0.5mmol/L和1.0mmol/L之间差异具有显著性（P<0.05）。②MnCl₂能特异性通过细胞膜上机械敏感性钙通道，熄灭细胞内钙离子荧光，在设定牵伸强度8%；频率0.5Hz；时间4h的条件下，分别用含0.5mmol及1mmol Mncl₂对细胞进行干预后与对照组（相同牵拉参数，但未经Mncl₂处理）相比，随着Mncl₂浓度的升高，细胞内钙离子荧光强度呈下降趋势，1mmol/L Mncl₂较0.5mmol/L能显著降低细胞内钙离子荧光强度,具有明显剂量依赖性，One-way ANOVA和Tamhane检验,0.5mmol/L和1.0mmol/L与对照组相比，差异具有显著性（P<0.05）。③硝苯地平，L型钙通道抑制剂。设定牵伸强度8%；频率0.5Hz；时间4h的条件下，分别应用20ummol/L及40ummol/L硝苯地平对细胞进行干预后与对照组（相同牵拉参数，但未经硝苯地平处理）相比，随着硝苯地平浓度的增加，细胞内钙离子荧光强度呈梯度降低，具有剂量依赖性，One-way ANOVA和Tamhane检验,20ummol/L和40ummol/L之间差异具有显著性（P<0.05）。3.细胞外钙内流及细胞内钙池钙释放共同介导了细胞内钙超载，钙调蛋白通路不是主要因素。①肝素能抑制IP3介导的钙池钙的释放，在设定牵伸强度为8%；频率0.5Hz；时间4h的条件下，分别应用50ug/ml及100ug/ml肝素对人肌腱细胞进行干预后与对照组（相同牵拉参数，但未经肝素处理）相比，随着肝素浓度的升高，细胞内钙离子荧光强度呈下降趋势，100ug/ml较50ug/ml荧光强度明显降低，具有显著的剂量依赖性，经单因素方差分析及Tamhane均数间比较，对照组与50ug/ml组及100ug/ml组之间的差异具有显著性，（P<0.05）。②三氟甲基吩噻嗪为钙调蛋白抑制剂，在设定牵伸强度为8%；频率0.5Hz；时间4h的条件下分别应用20ummol/L、40ummol/L及80ummol/L三氟甲基吩噻嗪对人肌腱细胞进行干预后与对照组相比（相同牵拉参数，但未经三氟甲基吩噻嗪处理），细胞内钙离子荧光强度无明显变化；20ummol/L、40ummol/L及80ummol/L三氟甲基吩噻嗪对细胞内钙离子荧光强度无显著抑制作用，经One-way ANOVA和Tamhane检验,20ummol/L和40ummol/L及80ummol/L之间差异无统计学意义（P＞0.05）。4..重复机械牵伸能诱导细胞外钙内流触发细胞内钙超载，钙超载可损伤细胞骨架F-actin为了验证机械牵伸是否能诱导人肌腱细胞外钙内流，本实验首先在设定牵伸强度为8%；频率0.5Hz；时间4h条件下，分别以3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L含钙培养基进行牵拉；同时用3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L含钙培养基在37℃、5%CO2培养箱内对细胞刺激4h，我们发现：3mmol/LCaCl₂牵拉组与非牵拉组相比，细胞内钙离子荧光强度无显著变化（P＞0.05）；而5mmol/LCaCl₂牵拉组与非牵拉组相比细胞内钙离子荧光强度显著增加（P<0.05）；10mmol/LCaCl₂牵拉组也观察到了类似的结果，但5mmol/L与10mmol/L牵拉组之间细胞内钙离子荧光强度无明显差异（P＞0.05）。经Two-way ANOVA和Tamhane检验，结果显示：3mmol/L与5mmol/L或10mmol/L组之间统计学差异具有显著性（P<0.05），而5mmol/L与10mmol/L牵拉组之间无统计学差异（P＞0.05）。以上结果显示：循环牵伸载荷能诱导人肌腱细胞膜上的钙通道开放，导致细胞外钙内流。3mmol/L含钙培养基刺激细胞4h时，细胞微丝排列稍紊乱，胞膜微丝较完整，胞浆微丝呈细颗粒状断裂，5mmol/L时，细胞轮廓消失，出现大量的细胞碎片，胞膜及胞浆微丝几乎全部断裂、解聚；在10mmol/L时，细胞微丝破坏及细胞碎片更加明显，可见细胞内钙超载能导致细胞F-actin的损伤，且F-actin的损伤与细胞内钙离子浓度具有剂量依赖性。三.过度牵伸载荷可诱导细胞骨架F-actin的损伤对照组细胞呈典型的长梭形，荧光强，细胞骨架F-actin呈弥漫状橘红色荧光样物质，分布清晰，细胞维持正常的形态，胞浆内肌动蛋白纤维丝方向不规则。设定牵伸频率0.5Hz、强度4%，时间2h时，细胞骨架微丝排列紊乱、模糊；牵伸4h时，微丝增粗、减少，呈颗粒状断裂；牵伸8h、12h、24h微丝均呈细颗粒状，断裂呈递增趋势；设定牵伸频率为0.5Hz、时间4h，强度8%时细胞骨架微丝解聚、断裂更加明显，F-actin分布总体减少；牵伸强度12%时，胞浆微丝已经全部断裂，仅有部分细胞膜微丝完整。设定牵伸频率为：1.0Hz，牵伸强度为：12%，牵伸时间分别为：2、4、8、12、24h时，细胞骨架微丝断裂呈梯度递增趋势，24h时F-actin已全部断裂。牵伸强度为4%与8%时，各时间点肌动蛋白微丝较对照组断裂明显对照组细胞微丝完整，荧光强度整体水平最高。设定牵伸频率0.5Hz、时间4h时，Two-way ANOVA及Tamhane检验，结果显示：在4%或者8%牵伸强度，与对照组比较，F-actin荧光强度下降（n=6），统计学具有显著差异（P＜0.01）;而在12%牵伸强度时，与8%比较，损伤没有进一步加重，无统计学差异（P＞0.05）。牵伸频率固定时（1.0Hz）随着牵伸强度递增，微丝的荧光强度呈梯度降低（P＜0.05），且有统计学意义；牵伸时间为8h时，各实验组细胞微丝荧光强度增加，但低于对照组；在0.5Hz时12%牵伸强度下随着牵伸时间的延长，F-actin表达量逐渐降低，24h时最低；牵伸强度及时间固定时，0.5Hz与1.0Hz之间荧光值无统计学意义（P＞0.05）。结论1、机械牵伸能激活人肌腱细胞膜上钙通道的开放，引起细胞外钙内流，触发细胞内钙释放，尤其是IP3诱导的细胞内钙池钙的释放是引起细胞内钙超载的主要来源；细胞内钙超载可加重肌腱细胞F-actin的损伤，细胞外钙离子的流动可能是人肌腱细胞感受机械应力，进行机械-生物化学信号转导的早期信号分子。2、过度牵伸载荷可诱导人肌腱细胞F-actin的解聚、断裂及重排，F-actin解聚、断裂与牵伸强度、时间正相关。3、细胞骨架的损伤、细胞外钙内流及细胞内钙池钙的释放共同介导了细胞内钙超载，最终导致肌腱内钙盐沉积，肌腱发生钙化。