一、研究背景及目的瘢痕疙瘩是人类特有的一种创伤后病理性瘢痕愈合现象,因其发病机理至今仍不甚清楚,所以一直是整形外科研究的热点。以往的研究结果表明,瘢痕疙瘩是遗传易感基因与外源性因素共同作用的结果,因此明确瘢痕疙瘩易感基因对于诊断和治疗具有深远意义。疾病家系具有较稳定的遗传背景和典型表型,家系研究是疾病分子遗传学研究的重要方法,利用家系标本进行相关染色体区域的定位候选基因克隆对于找到疾病易感基因具有重要价值。为此我们收集到东北一个瘢痕疙瘩大家系进行这方面的研究,此家系规模大、发病人数多,能较好地满足遗传病研究对家系的要求,对中国人群瘢痕疙瘩遗传学方面的研究,具有较好的代表性。家系样本来之不易,如何长期、稳定地保存家系资源是家系研究中不可忽视的环节。EB病毒是一种广泛存在的亲人类B淋巴细胞的疱疹病毒,能选择性转化人类B淋巴细胞使其成为具有持续分裂能力的淋巴母细胞样细胞系(LCL)。因此,运用EBV转化技术建立发病家系个体的永生化细胞库,只经一次采样即可长期保存该家系的完整基因信息,并提供足够的标本来源供持续研究使用,具有重大科研价值。疾病定位克隆是克隆群体中遗传疾病相关基因的一种有效手段。研究人员只要收集到能提供足够信息的疾病家系标本,确定疾病基因位点所在的染色体位置,通过直接筛查在该区域内的候选基因,就可能找到致病基因。课题组前期针对人SMAD蛋白基因所在的15q22.31-q23及18q21.1染色体区域,选择7个微卫星标记采用STR连锁分析的结果表明,D18S460和D18S467的最大两点LOD值分别为2.201和1.507,支持两标记位点与候选基因存在连锁关系。因此我们初步推断此瘢痕疙瘩家系易感基因可能位于18q21.1区域内。根据NCBI Mapviewer数据库18q21.1区域内基因的具体位置和基因的功能,选择Smad2基因为我们筛查的候选基因。查找Smad2基因的NCBI Locuslink、NCBI Sequence Viewer等网页的信息,确定该基因的结构,包括外显子数目、长度、是否编码等等。筛查其所有编码外显子,确定是否存在突变,为明确瘢痕疙瘩发病的分子机理学研究打下基础。二、研究对象与方法1.采集中国东北地区1个5代瘢痕疙瘩家系的临床资料及所有成员的外周血标本,建立个人临床信息资料档案(包括已故和无法到访的成员)。瘢痕疙瘩的诊断由2名具有丰富临床经验的整形外科医师,根据瘢痕疙瘩临床诊断标准(即瘢痕超过原有损伤范围并向周围正常皮肤侵犯,或瘢痕病程超过1年仍无自发消退征象,或术后瘢痕复发者)把家系成员分为瘢痕疙瘩发病者和未发病者,对所有发病和未发病的家系成员进行认真的体格检查、详细的病史询问和准确的临床诊断,并对瘢痕疙瘩发病部位照相取证。根据收集的临床资料,绘制家系系谱图,并对瘢痕疙瘩的遗传模式进行初步的分析。2.选择此家系中先证者家庭所在的唯一四代家庭共28人的外周血样本,利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞并加环胞霉素抑制T淋巴细胞建立永生细胞系的方法,建立此瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生细胞库;并对建系前后及冻存复苏传代后的淋巴细胞分别进行染色体G显带核型分析,比较其遗传性状的稳定性。3.取家系中4个患者(包括先证者)的外周血为研究对象,以其配偶的外周静脉血作为正常对照。抽提所有研究对象的外周血基因组DNA。然后以这些基因组DNA为模板,PCR扩增Smad2基因每一个编码外显子。采用基因测序技术对Smad2基因所有外显子进行突变检测。三、结果1.采集到中国东北地区1个5代瘢痕疙瘩发病家系的临床资料及56人的外周血标本,遗传分析发现此汉族瘢痕疙瘩家系的遗传模式符合常染色体显性遗传伴不完全外显,且存在表现度差异。临床表型有逐代减轻趋势。此家系以自发发病为主,初始发病年龄主要集中在16～25岁之间的青春期,好发于前胸部和肩背部,病变形态因发病部位不同而异,并具有对称性发病倾向。2.用于建立永生化细胞库的28例样本中,27例的淋巴细胞被成功转化、培养并建系,冻存1月后的细胞株复苏成功率为100%,表明建系成功。一次建系成功率达96.4%。细胞建系前后及冻存复苏传代后分别进行染色体G显带分析未见异常条带变化,表明转化后细胞核型稳定,保留了原有的遗传标志。3.基因测序检测瘢痕疙瘩家系8个标本Smad2基因的1-11外显子及其邻近内含子均未发现突变。四、结论1.采集到目前最大的一个汉族瘢痕疙瘩家系的完整资料和外周血样本,初步遗传学分析表明其遗传模式符合常染色体显性遗传伴不完全外显,但表现度存在差异。2.首次将EBV转化淋巴细胞技术用于瘢痕疙瘩家系遗传信息的永久保存,成功建立了此瘢痕疙瘩家系较完整的永生化细胞库。EBV转化技术可有效地长期、稳定保存人外周血淋巴细胞的遗传信息,对采集更多家系样本并加以长期保存具有重大的实用价值。3.初步排除Smad2为此瘢痕疙瘩家系致病基因。在染色体18q21.1区域内存在其它可能导致瘢痕疙瘩的致病基因;或者由于瘢痕疙瘩的高度遗传异质性,致病基因位点位于其他染色体上。