背景与目的具有笨并α吡喃酮环结构的香豆素型化合物,广泛分布于植物界中,具有多种药理作用,是天然存在的活性化合物。近年来的相关研究发现,香豆素化合物在体内外对多种肿瘤细胞均具有诱导其凋亡的作用,但是目前绝大多数的香豆素衍生物并没有被开发成为化学预防或治疗的药物,并且对于香豆素衍生物的研究主要集中于其药理作用方面,关于其体内生物利用度的报道研究较少。基于此,本论文选取了中药秦皮中的主要有效成分之一--七叶亭(esculetin,ET),以及结构与七叶亭极为相似的另一香豆素化合物--甲基七叶亭(methylesculetin,ME)作为研究对象,深入地研究这两个化合物的UGT代谢机理,为指导新药设计,临床前研究以及临床安全用药提供基本的理论基础。秦皮是北方常见的木犀科植物大叶白蜡树经炮制后的干燥枝皮或者树皮,临床常用于治疗痢疾、腹泻以及炎症肿痛,其主要有效成分为香豆素化合物。七叶亭是秦皮中最主要的有效成分,是研究秦皮的代表性化合物。研究表明,七叶亭具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用;甲基七叶亭,结构与七叶亭极为相似,是以七叶亭为母体,在其C-4位上接上一分子甲基的香豆素化合物,同样具有良好的药理活性。抗肿瘤作用是七叶亭和甲基七叶亭目前研究的热点,具有潜在的药用价值。从七叶亭和甲基七叶亭的化学结构来看,这两个香豆素化合物母核均有邻苯二酚结构,已有研究显示,带有邻苯二酚结构的化合物在体内极其容易被二相代谢酶中的葡萄糖醛酸转移酶所代谢,而这种首过效应可能会导致其生物利用度变差而无法发挥药理作用。另外,药物在体内的吸收和代谢处置过程中,除了药物代谢酶,还存在着外排蛋白对其的调控作用,这两者共同组成生物利用度屏障从而影响药物的药效。总的来说,药物代谢酶将进入细胞内的药物代谢为极性增大的代谢物,极性增大后的代谢物无法通过被动扩散排出细胞,此时将借助于外排蛋白的作用排出细胞,使代谢反应得以继续进行。抑制了外排蛋白能够降低药物在肝脏以及肠道的清除率,增加其在体循环的累积量,在生理上一方面能够提高药效,增强治疗作用,但也可能引发药物毒性作用,造成不良反应。因此,本论文的研究目的是基于药物代谢酶和外排蛋白研究七叶亭以及甲基七叶亭的UGT代谢机理,同时考察了高表达BCRP外排蛋白的Hela-UGT 1A9细胞对其UGT代谢作用以及从代谢产物的外排特征来探讨外排蛋白对代谢的影响,这将有利于我们深入理解七叶亭和甲基七叶亭在体内的处置情况,为提高生物利用度l使其成为可供临床应用的制剂提供重要的理论依据。实验方法建立快速,灵敏,高效的UPLC分析方法定量分析七叶亭、甲基七叶亭及其葡萄糖醛酸化代谢产物,采用12种重组人源化UGT亚酶及UGT 1A6,UGT 1A9的专属抑制剂来研究七叶亭和甲基七叶亭的UGT代谢机理;采用人肝、肠微粒体以及UGT isoforms对七叶亭和甲基七叶亭的酶代动力学特征进行研究;采用稳定表达UGT1A9以及高表达BCRP的Hela-UGT 1A9细胞模型来考察七叶亭和甲基七叶亭的UGT代谢机理,以及从代谢产物的外排特征来探讨BCRP外排蛋白对UGT代谢的调控机制。统计学处理:数据用mean±SD来表示。统计软件SPSS 13.0采用统计方法One-way ANOVA进行数据分析。实验结果1.七叶亭和甲基七叶亭UGT代谢机理研究1.1七叶亭和甲基七叶亭UGT代谢产物的鉴定通过LC/MS/MS和HRMS,我们对七叶亭和甲基七叶亭的葡萄糖醛酸代谢产物的结构进行了确证。结果显示七叶亭和甲基七叶亭在体外葡萄糖醛酸化代谢体系中分别产生了一个单葡萄糖醛酸结合产物。1.2 UGT1A及UGT2B家族对七叶亭和甲基七叶亭的代谢研究为了阐明参与七叶亭和甲基七叶亭的的主要UGT isoform,我们运用重组人源化UGT亚酶与10、30、100μM底物浓度的七叶亭和甲基七叶亭分别进行孵育,计算每分钟每毫克蛋白代谢产物的生成速率。我们发现UGT 1A6,UGT 1A7,UGT 1A9,UGT 2B15参与了七叶亭的葡萄糖醛酸化代谢,UGT 1A1,UGT 1A6,UGT 1A7,UGT 1A9则参与了甲基七叶亭的代谢,相比七叶亭,UGT2B家族并未参与甲基七叶亭的二相代谢;UGT 1A6以及UGT 1A9为代谢七叶亭以及甲基七叶亭的主要UGT亚酶。由于UGT 1A6、UGT 1A9以及UGT 2B15主要在表达于肝脏中,UGT 1A1在胃肠道和肝脏均具有表达,而UGT 1A7仅在肝外组织—胃肠道有表达,于是我们推测,肝脏和肠道可能为代谢七叶亭和甲基七叶亭的主要代谢器官。1.3 UGT亚酶抑制剂对七叶亭以及甲基七叶亭代谢的影响的研究为进一步验证参与七叶亭以及甲基七叶亭代谢的UGT酶亚型,我们考察了UGT特异性化学抑制剂:UGT 1A6特异性化学抑制剂苯基丁氮酮(phenylbutazone),UGT 1A9特异性化学抑制剂香芹酚(carvacrol)对七叶亭以及甲基七叶亭在人的肝脏中的葡萄糖醛酸化反应的影响。结果表明,与对照组相比,加入phenylbutazone的UGT 1A6与Human LiverMicrosome(HLM)反应体系中,七叶亭以及甲基七叶亭的代谢产物生产量均随抑制剂浓度的增加而降低(p<0.05,one way ANOVA);同样在加入carvacrol的UGT 1A9与Human Liver Microsome(HLM)反应体系中代谢产物的生产量也随着抑制剂浓度的增加而降低(p<0.05,one way ANOVA),说明UGT 1A6和UGT 1A9均为七叶亭和甲基七叶亭在肝脏代谢的最主要亚酶。1.4 UGT 1A6和UGT 1A9对七叶亭和甲基七叶亭的酶代动力学研究我们研究了七叶亭以及甲基七叶亭在UGT 1A6、UGT 1A9中的酶代动力学特征,发现无论是七叶亭还是甲基七叶亭,它们在UGT 1A6的最大反应速率以及清除率均大于UGT1A9,且它们的代谢类型均符合经典的米氏方程。另外无论是在UGT 1A6还是UGT 1A9,七叶亭的代谢速率都较甲基七叶亭高。1.5人肝、肠微粒体对七叶亭和甲基七叶亭的酶代动力学研究为了能够全面的了解七叶亭和甲基七叶亭的葡萄糖醛酸化代谢的特征,我们使用了人肝微粒体以及人肠微粒体来研究七叶亭和甲基七叶亭的酶代动力学特征,发现无论是七叶亭还是甲基七叶亭,它们在人肝微粒体以及人肠微粒体的代谢均符合经典的米氏方程;并且这两种化合物在肝脏的最大反应速率以及清除率均大于肠道,我们猜测肝脏是代谢七叶亭和甲基七叶亭的主要器官,肠道也参与其代谢,但其贡献没有肝脏大。另外无论是在肝脏还是肠道,七叶亭的代谢速率都较甲基七叶亭高。2.BCRP外排对七叶亭和甲基七叶亭UGT代谢的调控机制研究2.1比较七叶亭和甲基七叶亭在UGT 1A9和Hela-UGT 1A9 cell lysate的酶代动力学特征研究UDP-Glucuronosyltransferase(UGT)1A9-Overexpressing HeLa 细胞系简称为Hela-UGT1A9,是一种经过转染并可以稳定表达UGT1A9的Hela细胞系。该细胞系能够高表达外排转运蛋白BCRP,可用于研究代谢酶和外排转运蛋白BCRP相互作用对药物处置的影响。收集Hela-UGT1A9 cell lysate,通过比较七叶亭和甲基七叶亭在UGT1A9和Hela-UGT1A9 cell lysate的酶代动力学特征来验证Hela-UGTlA9细胞系是否是适用于研究药物UGT1A9代谢的模型。研究显示,无论是七叶亭还是甲基七叶亭,其在Hela-UGT1A9 cell lysate的酶代动力学参数Xm,Vmax与UGT1A9相似。2.2七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上的代谢与外排特征研究在本实验室的培养条件下,将Hela-UGT1A9以2×105个/孔的密度接种于六孔板中,经过3-4天培养,用于实验研究。采用此细胞模型分别考察了七叶亭在不同底物浓度下(即 20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM),其在Hela-UGT1A9细胞模型中的代谢外排特征。结果显示,七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上能迅速被代谢成葡萄糖醛酸代谢产物并排出细胞外。七叶亭葡萄糖醛酸代谢产物的外排速率结果显示代谢产物外排速率随着底物浓度的升高而增大。当七叶亭的浓度为120 时,代谢产物的外排速率达到最大;当底物浓度达到150 时,代谢产物的外排速率有一定程度的下降。随着七叶亭底物浓度的增加,代谓产物细胞内的累积量呈现增加的趋势,Fmet值显著性下降,同时代谢产物的细胞清除率CL也呈下降的趋势,七叶亭底物浓度为80 时,代谢产物细胞内清除率达到最大,但底物浓度高于80 时,代谢产物的细胞内清除率呈下降的趋势。2.3甲基七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上的代谢与外排特征研究实验同时还考察了甲基七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上的代谢情况,培养条件以及实验方案和七叶亭的一致,即把培养了 3-4天的Hela-UGT 1A9用于实验研究,分别考察了甲基七叶亭不同底物浓度下(即20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM)在Hela-UGT 1A9细胞模型中的代谢外排特征。结果显示甲基七叶亭在Hela-UGT 1A9细胞模型上能迅速被代谢成葡萄糖醛酸代谢产物并排出细胞外,其代谢产物外排速率随底物浓度增加而增加,代谢产物细胞内的累积量也呈现增加的趋势,代谢产物的细胞清除率CL有一定程度的下降,Fme值也显著下降。2.4 BCRP对七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上UGT代谢的调控机制研究我们考察了 BCRP专属性抑制剂Ko143对七叶亭在Hela-UGT1A9细胞上代谢和外排的影响。选择5、10μM Ko143,分别与20、80、200μM的七叶亭孵育,实验发现Ko143能够显著降低七叶亭代谢产物的外排速率,并且使细胞内代谢产物的累积量显著性增大,同时大大降低代谢产物的清除率;但对代谢产物的Fmet而言,当七叶亭的底物浓度为20μM,5、10μM Ko143分别可使七叶亭代谢产物的Fmet值降低了 18、29%;而当七叶亭底物浓度为80和200μM时,Ko143对代谢产物Fmet值的影响与对照组相比没有统计学意义。2.5 BCRP对甲基七叶亭在Hela-UGT1A9细胞模型上UGT代谢的调控机制研究我们考察了 BCRP专属性抑制剂Ko143对甲基七叶亭在Hela-UGT1A9细胞上代谢和外排的影响。选择5、10μM Ko143,分别与20、80、200μM的甲基七叶亭孵育,实验发现Ko143能够显著降低甲基七叶亭代谢产物的外排速率,并且使细胞内代谢产物的累积量显著性增大,同时大大降低代谢产物的清除率;但对代谢产物的Fmet而言,甲基七叶亭的底物浓度为20μM,5、10μM Ko143可使甲基七叶亭代谢产物的Fmet值分别降低了 11、20%;而当甲基七叶亭底物浓度为80和200μM时,10μM Ko143可使甲基七叶亭代谢产物的Fmet值分别降低了 10%和16%,而5μM Ko143对代谢产物Fmet值的影响与对照组相比均没有统计学意义。结论1.我们首次在体外研究了七叶亭和甲基七叶亭的葡萄糖醛酸代谢产物,并通过UPLC-MS/MS及HRMS对其进行了鉴定,结果显示这两个化合物在体外葡萄糖醛酸化代谢体系中分别产生了 一个单葡萄糖醛酸结合产物,无双葡萄糖醛酸结合产物;2.采用人肝、肠微粒体以及UGT isoforms深入地研究了七叶亭和甲基七叶亭的UGT代谢机理,推测这两个化合物的主要代谢器官可能为肝脏和肠道,并且肝脏的代谢要快于肠道。相比七叶亭和甲基七叶亭的葡萄糖醛酸化代谢速率,甲基七叶亭的代谢速率均较七叶亭低,提示结构的改变,特别是空间位阻的变化,能够改变UGT的代谢特征;3.七叶亭和甲基七叶亭可能为BCRP外排蛋白的底物,在较高浓度的时候可能抑制了 BCRP外排蛋白,导致化合物代谢产物细胞内累积量增大;另外,UGT代谢和BCRP的外排的偶联作用可能导致七叶亭和甲基七叶亭生物利用度变低。