研究背景神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,其发病率居脑肿瘤的首位,约占所有颅内肿瘤总数的40～50%。根据胶质瘤组织病理学特点和临床特征,WHO将其划分为Ⅰ-Ⅳ级四个级别,其恶性程度随着级别的升高而逐渐相应增强。其中多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)被划分为Ⅳ级,具有发病率高、复发率高、死亡率高和治愈率低的特点,中位数生存期仅为12-15个月,1年生存率平均约为46%,5年生存率不足3%。胶质瘤被发现已有百余年历史,通过人们不懈的努力,胶质瘤的诊断和治疗取得很大的进展,尤其近年来外科显微手术合并放化疗以及免疫辅助治疗取得了较大进步,但神经胶质瘤患者的预后仍然很不理想,尤其是高级别胶质瘤。证据表明,癌症易于复发、难以根治的重要原因是肿瘤细胞不可控制的生长和高侵袭性。因此阐明神经胶质瘤过度增殖和高侵袭转移特性的分子机制,将有助于开发治疗胶质瘤的新靶点,从而改善胶质瘤患者的预后。癌症的形成和发展是一个多因素、多基因相互协调作用的多阶段过程。恶性肿瘤细胞具备高侵袭性和转移性,从而导致肿瘤容易复发和难以根治。肿瘤转移包含多个步骤:原发部位肿瘤细胞降解基底膜并脱离原发瘤,侵袭周围组织呈浸润性生长,在血液、淋巴循环中运行并与血管内皮黏附,穿越管壁和基底膜继续生长形成继发瘤。蛋白酪氨酸磷酸化在多种生物学过程中发挥重要作用,包括细胞生长、组织分化、脂肪代谢、免疫应答和骨骼发育等。细胞内的蛋白酪氨酸磷酸化水平受到两种酶的严格调控:蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTP)。维持蛋白质酪氨酸磷酸化的正常水平在细胞间及细胞内通信、细胞的形态发育、基因转录和翻译、胚胎发育和内环境稳定等一系列生物学过程中发挥重要作用。酪氨酸特异性蛋白磷酸酶能够有针对性的去除附着到酪氨酸残基的磷酸基团,在细胞增殖,分化和凋亡、致癌转化的控制发挥非常重要的作用。蛋白酪氨酸磷酸酶H1(protein tyrosine phosphatase H1,PTPH1),又被称为酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体类型 3(tyrosine protein phosphatase non-receptor type 3,PTPN3),是PTP家族的一员,由PTPN3基因编码,定位于第9号染色体,转录mRNA产物全长6599 bp,编码868个氨基酸,含有一个C末端的PTP结构域、一个PDZ结构域和一个N末端结构域同源的细胞骨架相关蛋白超家族频带4.1结构。研究表明PTPH1在多种肿瘤的发生、发展中起到重要作用。例如,在胆管细胞癌中,外显子测序发现PTPH1基因存在突变,而且过表达PTPH1能够促进胆管细胞癌细胞增殖、克隆形成能力和侵袭迁移能力。在食管癌和乳腺癌临床样本中,PTPH1呈现高表达,而且其表达与乳腺癌患者肿瘤转移和预后相关。进一步研究发现,PTPH1通过作用于多种底物发挥其磷酸酶活性,从而在细胞行为中起到一定的作用,目前检测到的底物包括肿瘤坏死因子α转化酶,T细胞受体ζ亚基,维生素D受体,雌激素受体等等。然而,PTPH1在神经胶质瘤组织中的表达和功能目前尚未报道,本课题旨在检测胶质瘤患者临床样本中PTPH1的表达水平,并分析PTPH1在胶质瘤细胞增殖和侵袭迁移中的作用及其分子机制,从而为胶质瘤治疗提供新的药物作用靶点。目的1.检测神经胶质瘤临床组织样本PTPH1的表达情况。2.验证基因敲低PTPH1表达的效率。3.研究PTPH1对胶质瘤细胞增殖的影响。4.分析PTPH1对胶质瘤细胞周期分布的影响。5.探讨PTPH1对胶质瘤细胞周期相关蛋白表达的影响。6.研究PTPH1对胶质瘤细胞成瘤能力的影响。7.分析PTPH1对胶质瘤细胞侵袭及迁移能力的影响。8.探究PTPH1对胶质瘤细胞基质金属蛋白酶表达的影响。9.研究PTPH1影响胶质瘤细胞生长和迁移的分子机制。方法1.神经胶质瘤组织标本中PTPH1表达本研究前期收集了 15例神经胶质瘤患者配对的癌旁组织和神经胶质瘤组织,采用real time PCR技术检测PTPH1基因的表达情况。后期我们采集了2013-2015年在山东大学齐鲁医院进行胶质瘤切除术的患者肿瘤组织样品,并按WHO分级分别监测PTPH1表达情况,监测13例胶质瘤Ⅱ级、13例胶质瘤Ⅲ级、13例胶质瘤Ⅳ级、以及4例正常脑组织切片中的PTPH1的蛋白表达水平进行了免疫组化检测。2.PTPH1基因干扰效率设计并合成PTPH1特异性shRNA和scramble shRNA,构建慢病毒载体,并包被病毒质粒,病毒质粒用绿色荧光(GFP)标记,用以感染神经胶质瘤U87或U251细胞,用荧光显微镜观察感染情况,然后采用real time PCR检测空白对照组、scrambled shRNA组和PTPH1基因特异性shRNA组U87和U251细胞中PTPHlmRNA水平表达情况。最后再用Western blot测定空白对照组、scrambled shRNA组和PTPH1基因特异性shRNA组U87和U251细胞中PTPH1的蛋白表达水平。3.PTPH1对胶质瘤细胞增殖的影响将生长状态良好的神经胶质瘤U87或U251,按照1×106/孔的密度接种到96孔板中,每组设计3个复孔,采用CCK-8方法检测细胞活力;取生长状态良好的U87或者U251细胞接种到6孔板,每组设计3个复孔,调整细胞密度为100个/孔,用结晶紫染色液对形成的细胞克隆染色,并在光镜下观察细胞克隆数目。4.PTPH1对胶质瘤细胞周期分布的影响取对数生长期的U87或U251细胞,用预冷70%乙醇处理细胞,加PI试剂,采用流式细胞仪检测不同细胞周期细胞比例。5.PTPH1对胶质瘤细胞周期相关蛋白表达的影响取对数生长期的U87或U251细胞,收集并定量蛋白,采用western blot检测CDK2和cyclinB1蛋白表达强度。6.PTPH1对胶质瘤细胞成瘤能力的影响将裸鼠分为scrambled shRNA对照组和Lv-shPTPH1实验组,通过皮下注射正常表达PTPH1和干扰PTPH1表达的U87细胞分别皮下注射小鼠。在后续饲养过程中检测瘤体体积和重量。7.PTPH1对胶质瘤细胞侵袭及迁移能力的影响取生长状态良好的U87和U251细胞,采用无血清饥饿处理6h,收集细胞,调整细胞浓度为1×104/ml,采用Transwell方法检测scrambled shRNA组和PTPH1基因特异性shRNA组胶质瘤细胞侵袭及迁移能力。8.PTPH1对胶质瘤细胞基质金属蛋白酶表达的影响取对数生长期的U87或U251细胞,收集并定量蛋白,采用western blot检测MMP9蛋白表达强度。9.PTPH1影响胶质瘤细胞生长和迁移的分子机制取对数生长期的U87或U251细胞,收集并定量蛋白,采用western blot检测MEK和MAPK总蛋白表达以及相应磷酸化蛋白表达水平。结果1.神经胶质瘤组织标本中PTPH1表达我们首先检测了神经胶质瘤临床标本中PTPH1的表达情况。前期我们收集了 15例神经胶质瘤患者配对的癌旁组织和神经胶质瘤组织,并采用荧光定量PCR技术检测PTPH1基因的转录水平。结果显示,PTPH1在15例神经胶质瘤患者癌旁组织和神经胶质瘤组织中均有所表达;和癌旁组织相比,PTPH1在胶质瘤组织中表达水平显著上升(约3.5倍),差异有统计学意义,(P<0.01)。后期我们按照WHO分级再次分别对13例胶质瘤Ⅱ级、13例胶质瘤Ⅲ级、13例胶质瘤Ⅳ级、以及4例正常脑组织切片中的PTPH1的蛋白表达水平进行了免疫组化检测。结果显示,在各个级别胶质瘤中都极易检测到PTPH1的表达,且随着级别升高,PTPH1表达显著升高,而在正常脑组织中,PTPH1表达则显著下降,差异有统计学意义,(P<0.01)。2.PTPH1基因干扰效率我们通过包被慢病毒的方法将PTPH1基因特异性shRNA(Lv-shPTPH1)转染进入U87和U251神经胶质瘤细胞系中,同时转染scrambled shRNA作为实验对照组(Lv-shCon),同时还设置了空白对照组。结果显示,95%以上的U87和U251胶质瘤细胞均成功感染携带Lv-shCon和Lv-shPTPH1的病毒质粒。和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞中PTPH1的mRNA表达水平几乎没有变化;和scrambled shRNA对照组相比,转染Lv-shPTPH1的U87和U251细胞中PTPH1的mRNA表达水平显著下降(P<0.01)。此外,转染Lv-shPTPH1的U87和U251细胞中PTPH1蛋白表达水平明显降低。3.PTPH1对胶质瘤细胞周期和细胞增殖的影响3.1和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞周期没有显著差别。然而,干扰PTPH1基因的U87胶质瘤细胞中G2/M期细胞数量占所有细胞数量的比例减少18%,S期细胞数量占所有细胞数量的比例增加9%。此外,干扰PTPH1基因表达同样引起U251细胞周期S期阻滞。3.2和空白对照组相比,转染scrambled shRNA的U87和U251胶质瘤细胞中CDK2和cyclinB1蛋白表达没有显著差别;PTPH1基因敲低后导致U87和U251胶质瘤细胞中CDK2和cyclinB1蛋白表达明显下调。3.3在细胞培养的前两天,空白对照组、scrambled shRNA组和Lv-shPTPH1组细胞活力没有明显差别;当细胞培养到第3天,干扰PTPH1导致U87和U251神经胶质瘤细胞活力分别下降46%和18%;并且从第3天开始,U87和U251神经胶质瘤细胞活力持续下降(P<0.01或者P<0.05);当培养到第5天,PTPH1干扰后的U87和U251细胞活力分别是对照组细胞活力的45%和76%。克隆形成实验显示,PTPH1干扰导致U87和U251细胞数量分别下降73.5%和80.7%。3.4当小鼠饲养至第16天时,两组小鼠在肿瘤大小方面没有明显区别(P>0.05)。当饲养至第20天时,注射干扰PTPH1表达的U87细胞的小鼠的肿瘤体积缩小14.3%,并且肿瘤缩小的趋势随着饲养时间的增加愈加明显。此外,干扰PTPH1表达导致肿瘤重量明显下降。4.PTPH1对胶质瘤细胞侵袭及迁移能力的影响Transwell侵袭及迁移实验表明,空白对照组和scrambled shRNA组中胶质瘤细胞的侵袭及迁移能力没有明显差别;和scrambled shRNA组相比,PTPH1基因敲低后U87和U251细胞侵袭及迁移能力分别下降60%和53%。Western blot结果表明,空白对照组和scrambled shRNA组胶质瘤细胞MMP9的蛋白表达水平没有明显差别;然而,和对照组相比干扰PTPH1表达导致U87和U251细胞中MMP9蛋白表达水平显著降低。5.PTPH1影响胶质瘤细胞生长和迁移的分子机制Western blot结果显示,和空白对照组相比,scrambled shRNA组胶质瘤细胞MEK磷酸化水平没有显著变化;干扰PTPH1导致U87和U251细胞中MEK的磷酸化水平明显降低,但MEK总蛋白表达水平保持不变。此外,我们发现干扰PTPH1表达导致U87和U251细胞中MAPK的磷酸化水平显著下调,但MAPK总蛋白水平没有明显变化。结论通过本研究,我们发现神经胶质瘤组织中PTPH1的表达水平明显上调;干扰PTPH1表达能够明显降低细胞周期蛋白的表达,引起胶质瘤细胞周期阻滞,从而抑制胶质瘤细胞增殖和成瘤能力;此外,我们发现干扰PTPH1表达能够影响细胞基质蛋白酶的表达,并能够降低MEK和MAPK的磷酸化水平,影响细胞信号通路传导信号,从而抑制胶质瘤细胞侵袭及迁移能力。