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第一部分肺炎支原体抗体及肺炎支原体DNA检测的对比研究目的:探讨血清肺炎支原体抗体和鼻咽抽吸物(NPA)肺炎支原体DNA检测方法在呼吸道肺炎支原体(MP)感染中的临床意义和价值。方法:将2015年01月至2018年12月期间因呼吸道感染收住入苏州大学附属儿童医院呼吸科并满足下列条件的患儿为本研究对象。研究对象条件:年龄1个月～14岁;入院后采集鼻咽抽吸物(NPA)标本,并采用实时聚合酶链反应(PCR)技术进行MP-DNA检测;检测急性期和恢复期双份血清MP-IgM和IgG的滴度;排除免疫抑制患儿及接受过免疫抑制治疗的患儿。满足条件共2839例患儿。所有研究对象入院后24小时内采集外周静脉血样本,出院前(治疗7～10天病情好转时)采集第二份外周静脉血样,进行血清MP特异性抗体检测。入院24h内采集NPA1～2mL,采用实时荧光定量PCR法进行NPA MP-DNA检测。实验室检测判断MP 阳性标准:(1)实时荧光定量PCR法检测NPA MP-DNA,拷贝数>1x104。(2)入院24h内外周静脉血半定量法检测MP-IgM结果,比值>1.1。(3)出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低。MP感染确诊标准:NPA MP-DNA拷贝数>1x104,以及NPA MP-DNA拷贝数小于1x104但出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低。收集入组患儿的临床资料,包括年龄、性别、病程及临床症状、临床诊断、相关实验室检查等,根据不同方法检测MP结果进行比较研究。结果:1.2839例入院后采集NPA标本进行MP-DNA检测以及检测急性期和恢复期双份血清MP-IgM和IgG滴度的患儿,其中NPA MP-DNA拷贝数>1 x 104有350例,NPA MP-DNA拷贝数小于1x104的患儿中,出院前与入院24h内外周静脉血MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低有250例。MP阳性检出共600例,总 MP 阳性检出率 21.13%(600/2839)。2.2839例NPA标本实时荧光定量PCR法检测MP-DNA,阳性检出率12.33%(350/2839);入院24h内外周静脉血(第一份血清)半定量法检测MP-IgM,阳性检出率23.11%(656/2839);出院前与入院24h内外周静脉血(双份血清)MP-IgM、MP-IgG检测比较呈4倍或4倍以上增高或减低,阳性的患儿为394例,阳性率为13.88%(394/2839)。第一份血清MP-IgM阳性检出率明显高于NPA MP-DNA及双份血清MP-IgM、MP-IgG检测,差异有统计学意义(χ2=140.371,P<0.001)。3.将600例确诊支原体感染的患儿按照年龄组分别进行NPAMP-DNA及MP双份血清抗体阳性检出率比较,≤1岁组NPAMP-DNA阳性检出率为71.76%(122/170)明显高于MP双份血清抗体的41.18%(70/170),两者相比有统计学意义(χ2=32.354,P<0.001);～3岁组NPAMP-DNA阳性检出率与MP双份血清抗体,两者相比无统计学意义(P=0.204);～6岁组NPAMP-DNA 阳性检出率57.14%(84/147)明显低于MP双份血清抗体的79.59%(117/147),两者比较差异有统计学意义(χ2=17.128,P<0.001);>6岁NPA MP-DNA阳性检出率40.43%(38/94),明显低于MP双份血清抗体的85.11%(80/94),两者相比有统计学意义(χ2=40.149,P<0.001)。MP双份血清抗体检测法及NPA MP-DNA在不同年龄组比较,阳性检出率差异均有统计学意义(P<0.001)。4.将600例确诊支原体感染的患儿根据临床获取实验室检测标本时呼吸道感染患儿的病程,分为<3d,～5d,～7d,～10d,～14d,～21d及>21d的7个时段组,比较不同病程内NPA MP-DNA的阳性检出率。MP-DNA检出率在病程10天以内随着时间的增加阳性检出率上升,病程～10d组患儿MP-DNA的阳性检出率最高,达78.21%,此后随着病程的延长,NPAMP-DNA的阳性检出率逐渐下降,病程>21d组阳性检出率仅为37.5%;不同病程内NPA MP-DNA的阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=31.515,P<0.001)。5.在600例MP感染确诊患儿中,NPAMP-DNA阳性同时双份血清阳性的患儿占144例,NPA MP-DNA 阳性而双份血清阴性为206例,双份血清阳性而NPA MP-DNA阴性的为250例,两者检测方法的敏感性之间的一致性一般(Kappa=0.604)。6.在350例NPA MP-DNA 阳性的患儿中,第一份IgM 阳性的患儿为229例(65.43%),第一份IgM阴性的患儿为121例(34.57%);第一份IgM阳性的患儿在复查第二份血清抗体后有54例(15.43%)有4倍升高或降低,第一份IgM阴性的患儿复查第二份血清抗体后有90例(25.71%)有4倍改变,故在350例患儿中,总的双份血清阳性患儿人数为144例(41.14%)。7.将350例NPAMP-DNA检测法为阳性的患儿根据临床获取实验室检测标本时呼吸道感染患儿的病程,分为<3d,～5d,～7d,～10d,～14d,～21d及>21d的7个时段组,比较不同病程内第一份IgM为阳性的阳性检出率。MP-IgM的阳性检出率～7d显著上升,～10d达高峰,然后缓慢下降;在病程～10d时间段,NPAMP-DNA检测法与MP单份血清IgM为阳性的一致性最好,达到91.80%,不同病程内MP单份IgM的阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=65.812,P<0.001)。结论:1.≤1岁组应用NPAMP-DNA检测阳性检出率高,～6岁及>6岁组MP双份血清抗体阳性检出率高,而～3岁组NPAMP-DNA与MP双份血清抗体阳性检出率相仿。2.NPAMP-DNA检出率在病程10天以内随着时间的增加阳性检出率上升,在病程7～10d 阳性检出率最高。3.在病程～10d时间段,NPA MP-DNA检测法与MP单份血清IgM为阳性的一致性最好。4.临床中以单份血清MP-IgM 阳性作为MP近期感染的指标存在假阳性风险。第二部分肺炎支原体感染后抗体产生的影响因素目的:对鼻咽部抽吸物检测MP-DNA 阳性但第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均为阴性患儿,探讨导致MP感染后抗体无法产生的可能原因。方法:在第一部分确诊为支原体近期感染的600例患儿中选取NPA MP-DNA>1x104且第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均为阴性的31例患儿、及NPA MP-DNA>1x104且双份血清MP抗体为阳性的144例患儿为研究对象。根据年龄分组:≤1岁组和>1岁组。收集入组患儿的临床病史资料以及入院24小时内、出院外周静脉血双份血常规和淋巴细胞亚群、免疫球蛋白检测结果,将第-份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性患儿与双份血清MP抗体阳性患儿进行临床及实验室检测对比研究。结果:1.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性患儿,≤1岁组占80.65%,明显多于双份血清阳性组的6.25%,两者比较差异有统计学意义(P<0.001)。2.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组CD3+、CD3+CD8+比值分别为 66.6(61.2-73.6)、25.2(21.2-29.9)高于双份血清 MP 抗体阳性组 62.6(60.1-70.3)、19.5(17.0-23.0);第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组CD3+CD4+、CD3-CD19+、CD19+CD23+、CD3-CD(16+56+)比值分别为 34.8(30.1-40.9)、17.2(13.4-24.7)、7.9(5.8-11.7)、10.2(6.8-16.7)明显低于双份血清阳性组 41.1(33.6-45.0)、21.3(13.1-24.7)、13.5(13.1-24.7)、13.5(13.1-24.7)。第一份血清 MP-IgM 和双份血清MP抗体均阴性组CD4+/CD8+比值为1.4(1.0-1.8)明显低于双份血清MP抗体阳性组2.0(1.7-2.7),差异均有统计学意义(P<0.001)。3.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组IgA定量0.14(0.04-0.42),显著低于双份血清MP抗体阳性组1.17(0.84-1.49),两者差异有统计学意义(Z=-17.519,P<0.001);第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组IgG定量为5.29(4.30-7.19),显著低于双份血清MP抗体阳性组的9.22(7.9-11.00),两者差异有统计学意义(Z=-14.654,P<0.001);第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组IgM定量为0.77(0.41-1.17),显著低于双份血清MP抗体阳性组1.13(0.88-1.45),两者差异有统计学意义(Z=-9.497,P<0.001)。4.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组双份血常规血小板计数升高比例为65.52%,明显少于双份血清MP抗体阳性组的93.62%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论:1.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组,多见小年龄组、并以<1岁婴儿为主。2.第一份血清MP-IgM和双份血清MP抗体均阴性组患儿,外周血淋巴细胞亚群的比较及双份血常规血小板计数动态升高比例提示免疫系统功能发育未完善以及存在免疫功能受抑制状态的患儿,可表现出MP感染后特异性抗体不能正常表达感染后产生及升高现象。