目的:1.通过离体培养大鼠星形胶质细胞,观察P物质对星形胶质细胞的活化作用,包括细胞形态学观察和对IL-1β和IL-10释放量的检测。2.通过P物质作用于离体培养的星形胶质细胞,观察星形胶质细胞胞内Ca2+浓度的变化,探讨活化可能的机制。方法:1.取出生24 h以内的SD乳鼠原代培养星形胶质细胞。将培养的星形胶质细胞分为5组:(1)对照组,细胞孵育全培液;(2)全培液+P物质30 n M组;(3)全培液+P物质100 n M组;(4)全培液+P物质300 n M组;(5)全培液+P物质1000 n M组。各组细胞分别在孵育2 h、6 h、12 h、24 h后收集细胞上清液同时保留细胞,以便进行后续实验。2.采用免疫细胞荧光法鉴定GFAP阳性的星形胶质细胞,并观察P物质孵育后星形胶质细胞在各浓度以及各时间点的形态变化。3.采用ELISA的方法检测P物质孵育后星形胶质细胞在各浓度及各时间点释放IL-1β和IL-10的情况。4.利用比例高内涵成像系统的胞内钙离子成像技术观察P物质作用于星形胶质细胞后,其胞内Ca2+浓度的变化。结果:1.培养的星形胶质细胞的鉴定:经免疫细胞荧光法鉴定,培养的细胞为GFAP阳性的星形胶质细胞。用DAPI复染后,证实细胞的纯度达95%以上。2.P物质孵育星形胶质细胞后的形态学改变:以细胞孵育全培液作为对照组。30 n M的P物质孵育星形胶质细胞后的2 h、6 h、12 h、24 h分别与之比较,其形态几乎无变化。100 n M的P物质孵育星形胶质细胞后的6 h,部分细胞的胞体开始变大变圆,突起回缩,呈现出活化的形态学表现,且随着时间的延长,至12 h发生这种形态变化的细胞数目逐渐增多,GFAP的免疫染色也增强。300 n M的P物质孵育星形胶质细胞后的6 h、12 h,呈现活化态的细胞数目均较100 n M组增加,此外GFAP的免疫染色也较100 n M组增强。1000 n M的P物质孵育星形胶质细胞后2 h,细胞形态开始出现上述变化,但至6 h、12 h时GFAP的免疫染色均低于100 n M、300 n M组。100 n M、300 n M组的星形胶质细胞在孵育至24 h时GFAP的免疫染色均较12 h时减弱。3.IL-1β的检测结果:以细胞孵育全培液组的细胞上清液作为对照组。30 n M的P物质作用于星形胶质细胞后的2 h、6 h、24 h,细胞上清液中的IL-1β含量与对照组相比,差异无统计学意义,而12 h细胞上清液中的IL-1β含量高于对照组,差异有统计学意义。100 n M、300 n M的P物质作用于星形胶质细胞后的2 h、6 h、12 h,细胞上清液中的IL-1β含量较对照组增加,差异有统计学意义。而24 h细胞上清液中的IL-1β含量与对照组相比,差异不再有统计学意义。说明P物质作用于星形胶质细胞后,促进其释放IL-1β,而且具有特定的时间过程。30 n M的P物质促进星形胶质细胞释放IL-1β的作用在12 h最明显,至24 h该作用消失。100 n M、300 n M的P物质促进星形胶质细胞释放IL-1β的作用在2 h开始,在6h作用最强,之后随着时间的延长,该作用逐渐减弱,至24 h该作用几乎消失。4.IL-10的检测结果:以细胞孵育全培液组的细胞上清液作为对照组。30 n M、100 n M、300 n M的P物质作用于星形胶质细胞后的2 h、6 h,细胞上清液中的IL-10含量与对照组相比均减少,差异有统计学意义。30 n M、100 n M、300 n M的P物质作用于星形胶质细胞后的12 h,细胞上清液中的IL-10含量与对照组相比,差异无统计学意义。30 n M、100 n M、300 n M的P物质作用于星形胶质细胞后的24 h,细胞上清液中的IL-10含量与对照组相比增加,且差异有统计学意义。说明P物质作用于星形胶质细胞的最初2 h和6 h内,抑制其释放IL-10。然而随着时间的延长,P物质对星形胶质细胞释放IL-10的抑制作用逐渐减弱。5.胞内钙离子成像结果:以细胞孵育Hanks液作为对照组,60 m M的kcl用于检测星形胶质细胞的功能活性。30 n M、100 n M、300 n M、1000 n M的P物质作用于星形胶质细胞后,其胞内钙离子的浓度与对照组相比均增高,差异有统计学意义。100 n M的P物质作用于星形胶质细胞后,其胞内钙离子的浓度高于30n M、300 n M、1000 n M的P物质组,差异有统计学意义。300 n M的P物质作用后,星形胶质细胞内钙离子的浓度高于30 n M、1000 n M的P物质组,差异有统计学意义。而1000 n M的P物质作用后,星形胶质细胞内钙离子的浓度与30 n M的P物质相比,差异无统计学意义。以上说明,P物质作用于星形胶质细胞后,其胞内钙离子的浓度升高。其中,以100 n M的P物质作用于星形胶质细胞后引起的胞内钙离子浓度的升高最为显著。结论:1.P物质能够诱导星形胶质细胞呈现出活化态形态改变。2.P物质能够促进星形胶质细胞释放促炎因子IL-1β,抑制星形胶质细胞释放抗炎因子IL-10。3.P物质对星形胶质细胞的活化作用可持续约12 h,至24 h时该作用减弱甚至消失。4.P物质作用于星形胶质细胞后,其胞内钙离子的浓度升高。100 n M P物质的作用最强。5.P物质诱导星形胶质细胞活化参与疼痛的形成,可能与钙离子信号转导途径的激活以及促进其释放IL-1β并抑制其释放IL-10有关。慢性神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤造成的,其主要表现为异常的痛感受,包括触诱发痛(正常非伤害性刺激引起的疼痛)和痛觉过敏(对伤害性刺激过度的痛反应)。慢性疼痛可以持续数月,给病人带来极大痛苦,而临床上也缺乏有效的治疗手段。以往痛觉几十年的研究取得了巨大的成就,对痛觉的中枢区域、不同中枢的功能作用及相互联系、局部的神经环路、痛觉感受器的感受机制、参与痛觉传递的神经化学物质等有了深入了解。但既往的研究主要关注神经元、神经元构成的环路及神经递质的作用。而且基于上述研究结果设计的药物也是以参与痛觉传递的神经元为靶标,虽有一定疗效但对慢性疼痛的治疗效果并不理想。近些年神经胶质细胞在痛信号产生、传递、痛觉形成中的重要作用被逐渐予以重视,已经成为痛觉研究及治疗的重要靶点。在神经系统内,神经胶质细胞的数目远多于神经元,越来越多的资料显示胶质细胞在神经生理及病理条件下的功能作用非常重要。研究发现疼痛模型的动物在慢性疼痛发生时伴随有脊髓内神经胶质细胞的活化,表现为胞体肥大,树突回缩,表面标记蛋白表达增多等现象。鞘内或者全身应用神经胶质细胞代谢抑制剂后,胶质细胞活化减弱,同时慢性疼痛症状也得到缓解。这些结果均提示,慢性疼痛的形成与脊髓神经胶质细胞的活化相关。但由于神经系统是由神经元和神经胶质细胞构成的复杂环路,常规的疼痛研究模型无法对神经胶质细胞进行深入、系统的观察,其研究结论也难以排除神经元的影响。因此神经胶质细胞在疼痛信号产生、传递过程的作用及机制,如胶质细胞如何活化,活化后如何发挥作用等并不明确。研究表明,痛模型的大鼠在损伤部位应用局部麻醉药利多卡因之后脊髓内GFAP的表达减少,而GFAP是星形胶质细胞的特异标记蛋白,这些结果表明,伤害性刺激通过神经元继而引起中枢神经胶质细胞的激活。提示经神经元向脊髓传递的伤害性信号可能是星形胶质细胞活化的启动因素。外周感觉神经元向脊髓传递感觉信号的物质基础是神经递质,P物质属于速激肽家族,是脊髓水平传递痛信号特异的神经递质。NK1受体是P物质的特异性受体,研究发现NK1受体在神经胶质细胞也有分布。常规在体实验结果是基于神经元和胶质细胞网络所获得的,这种方式无法明确P物质对星形胶质细胞的直接效应,即P物质是否会对星形胶质细胞产生直接刺激使其激活、激活的途径是什么,如是否会通过星形胶质细胞合成、释放细胞因子(包括炎性因子和促炎因子)参与疼痛的传递和调节。因此本研究将采用离体实验观察痛特异的神经递质P物质对星形胶质细胞的活化作用及相关机制。