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1.研究背景和目的食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,世界卫生组织2014年世界癌症研究报告指出:中国食管癌的发生率约占全球50%左右,是世界上食管癌最高发的国家。早期食管癌患者临床多无明显的特异性症状,被发现时大部分患者已属于中晚期,生活质量偏低下,总的5年生存率不足20%。我国食管癌较突出的两个特点是明显的地域特征和家族聚集现象。不同地区,不同家族史患者的生存期有明显差别,另外肿瘤期别、患者年龄、吸烟饮酒等饮食习惯、遗传易感性、病理类型、大体类型、肿瘤部位、治疗方式等也可以影响食管癌患者的生存期,但是临床上逐渐发现以上因素相同的患者不同性别间生存期存在差异。既往有关食管癌性别间差异的研究,都是针对某一个或几个临床特征之间的对比分析,没有系统或较大样本量的对比研究。本文旨在大样本的对食管癌不同性别间各临床病理参数及生存期进行对比分析;研究性激素受体:雌激素受体(estrogen receptor,ER)(包括ERα和ERβ)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和雄激素受体(androgen receptor,AR)对食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者生存期的影响及在男女ESCC组织中的表达;并对ESCC患者的癌及癌旁组织进行全外显子测序(whole exome sequence,WES)及部分相关蛋白P53、E-钙黏蛋白1(Cadherin1,CDH1)进行免疫组化检验,希望找到影响食管癌男女生存期差异的机制,为后续食管癌的性别差异、发病机制及预防的研究找到强有力的数据支持和理论依据,为治疗食管癌提供新的思路。2.材料与方法2.1研究对象研究对象均来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点实验室资料库,均病理证实为原发食管癌患者,不合并其他肿瘤,生存期明确,确诊时间为1973年-2017年,有准确的病历号和病理号,有详细的家庭住址或有效的电话联系方式,能随访到患者本人或直系亲属。2.2研究方法2.2.1流行病学调查对来自安阳市肿瘤医院的23,269例食管癌患者的一般信息、临床病理信息进行男女间的比较,及以上指标相同条件下男女单因素生存分析,并对食管癌患者进行多因素生存分析。2.2.2免疫组织化学常规免疫组织化学、HE染色。利用免疫组织化学技术检测1,035例(男性711例,女性324例)ESCC患者的癌及癌旁对照组织中ERα、ERβ、PR和AR蛋白表达情况,并就其表达情况进行ESCC患者预后生存分析。2.2.3 WES及部分相关蛋白验证WES:用DNA提取试剂盒提取ESCC组织及癌旁正常组织,质检合格后,建立DNA文库,进行文库质检后采用二代测序平台进行WES。采用标准化流程比对分析数据,最终筛选出与ESCC相关的高频突变基因和突变类型。对筛选出来的突变类型的频率,采用非负矩阵分解(Non-negative Matrix Factorization,NMF)的方法将点突变分解为多个不同的突变特征,然后与已知的30种突变特征进行聚类分析,利用与样本突变特征相似的已知特征的注释信息解释样本突变过程。比较男女ESCC患者间高频突变基因、突变特征有无差异,同时对部分相关蛋白在ESCC中的表达情况及对预后的影响进行分析。进入测序部分样本例数为523例,测序样本中375例进行免疫组化实验;进行免疫组化样本除进行测序的375例外,增加样本量至5,736例。2.2.4统计方法采用SPSS21.0统计软件,采用卡方检验分析男女性临床病理因素的差异,性激素受体蛋白、P53蛋白、CDH1蛋白表达阳性率、男女性阳性表达率差异,以及P53蛋白、CDH1蛋白阳性表达、阴性表达中相应基因突变率,采用Kaplan-Meier及Cox多因素回归分析以上指标与患者预后关系,检测标准均取α=0.05。3.结果3.1男女食管癌患者流行病学调查及生存分析3.1.1临床病理特征及单因素生存分析3.1.1.1一般情况及生活方式男女发生率及生存期差异共入组食管癌患者23,269例,其中男性14,408例(61.0%),女性8,861例(39.0%),男性发病率明显高于女性,男/女=1.63;在诊断年龄小于等于55岁、诊断年龄大于55岁、有吸烟史、有饮酒史、已婚患者、结婚年龄小于等于20岁及结婚年龄大于20岁患者中均有男性比例高于女性,且差异均有统计学意义(P<0.05);以上任何一因素相同时,均有女性生存期长于男性,差异有统计学意义(P<0.05)。3.1.1.2临床病理特征男女发生率及生存期差异在家族史、高低发区、发生部位、病理类型、早中晚分期、淋巴结转移、T分期、N分期、TNM分期、病理分级方面男女发病率差异均有统计学意义(P<0.05);在分化程度和M分期方面,男女发病率差异无统计学意义(P>0.05);以上临床病理参数某一因素相同时,绝大部分存在女性生存期长于男性,差异有统计学意义(P<0.05)。3.1.1.3治疗方式男女发生率及生存期差异男女均以单纯手术治疗为主要治疗方式。单纯手术、单纯放疗和单纯化疗男性所占比例均高于女性,都存在女性生存期长于男性,差异有统计学意义(P<0.05)。3.1.2多因素生存分析(COX回归)性别(男vs.女,HR=0.830,95%CI:0.752-0.916);诊断年龄(≥55岁vs.≤55岁,HR=1.307,95%CI:1.183-1.444);家族史(阳性vs.阴性,HR=1.099,95%CI:1.018-1.188);发生部位(颈段vs.胸上段vs.胸中段vs.胸下段,HR=0.861,95%CI:0.808-0.916);分化程度(高分化vs.中分化vs.低分化vs.未分化,HR=1.167,95%CI:1.103-1.235);N分期(N0 vs.N1 vs.N2 vs.N3,HR=1.222,95%CI:1.143-1.306);病理分级(I期vs.II期vs.III期vs.IV期,HR=1.164,95%CI:1.016-1.334);早中晚分期(早期vs.中晚期,HR=1.286,95%CI:1.081-1.529)是影响食管癌患者预后的独立危险因素。3.2性激素在男女ESCC组织中的表达及生存分析3.2.1性激素受体在男女性ESCC患者组织中的表达3.2.1.1 ERα、ERβ、PR和AR蛋白在癌细胞的胞浆和胞核内均有表达。3.2.1.2女性ESCC患者ERα、ERβ、PR阳性表达率均高于男性ESCC患者,AR阳性表达率男性高于女性,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.2.1.3男女ESCC患者癌组织中ERα、ERβ、PR和AR蛋白阳性表达率在诊断年龄、家族史、高低发区、淋巴结转移、病理分级等方面有差异,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.2性激素受体与ESCC患者生存预后分析3.2.2.1单因素生存分析ERα、ERβ、PR和AR蛋白是影响ESCC患者预后的因素;ERα、ERβ、PR蛋白阳性患者的生存期长于表达阴性的患者(P<0.05),AR蛋白阳性患者的生存期短于表达阴性的患者(P<0.05);ERα、PR蛋白阳性患者中男女生存期差异无统计学意义(P>0.05),ERβ、AR蛋白阳性患者中男女性患者生存期差异有统计学意义(P<0.05)。3.3.2.2多因素生存分析ERb(HR,0.673,95%CI:0.567-0.798)和AR(HR,1.572,95%CI:1.306-1.892)是影响ESCC预后的独立危险因素。3.3男女ESCC组织WES、部分相关蛋白表达及与生存期的关系3.3.1 WES3.3.1.1体细胞突变男性体细胞突变数目明显多于女性,男女体细胞突变比例差异无统计学意义(P>0.05)。3.3.1.2高频突变基因检测到高频突变基因共114个,与ESCC生存期有关的关键基因13个,包括P53、CDH1等。114个高频突变基因,男女ESCC间无显著差异(P>0.05)。3.3.1.3碱基置换突变类型及突变特征男女ESCC患者6种碱基置换突变类型(C>A/G>T,C>G/G>C,C>T/G>A,T>A/A>T,T>C/A>G和T>G/A>C)中,有3种碱基置换突变类型(C>T/G>A,T>C/A>G,T>G/A>C)在男女两组样本中所占比例差异有统计学意义(P<0.05);检测到两个突变特征:signature.1和signature.17,在男女ESCC间差异有统计学意义(P<0.05)。3.3.1.4 P53和CDH1突变情况男女ESCC患者P53、CDH1基因突变率、点突变率、6种碱基置换突变类型所占比例差异均无统计学意义(P>0.05);P53蛋白阳性表达、阴性表达中基因突变率分别为67.5%和58.8%,差异无统计学意义(P>0.05);P53基因突变、未突变患者间生存期差异无统计学意义(P>0.05);P53蛋白表达阳性中不同基因突变类型ESCC患者生存期差异有统计学意义(P<0.05);P53蛋白阳性表达、阴性表达患者基因突变类型比率差异有统计学意义(P<0.05),蛋白表达阳性者中,突变类型以错义突变比率最高;CDH1蛋白阳性表达、阴性表达中基因突变率分别为1.0%和9.7%,差异有统计学意义(P<0.05)。3.3.2 P53和CDH1在男女食管癌组织中的表达及生存分析3.3.2.1男女ESCC组织中P53和CDH1蛋白表达P53和CDH1蛋白在ESCC中均有表达,P53蛋白主要在细胞核表达,CDH1主要在细胞膜表达;男女ESCC阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。3.3.2.2 P53和CDH1蛋白表达与ESCC患者预后的生存分析P53蛋白和CDH1蛋白均有阳性表达患者生存期短于阴性表达者,阳性表达患者女性生存期优于男性,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.结论4.1男女食管癌患者在诊断年龄、吸烟史、饮酒史、是否结婚、结婚年龄、婚姻状况、家族史、高低发区、发生部位、病理类型、早中晚分期、淋巴结转移、分化程度、病理分级和治疗方式方面所占比例有差异;单因素生存分析显示:诊断年龄、吸烟史、是否结婚、结婚年龄、婚姻状况、家族史、高低发区、发生部位、分化程度、淋巴结转移、T分期、N分期、M分期、TNM分期、早中晚分期及治疗方式是影响男女食管癌患者预后的因素;Cox多因素生存分析显示:性别、诊断年龄、家族史、发生部位、分化程度、N分期、病理分级和早中晚期是影响食管癌预后的独立因素;4.2 ERα、ERβ、PR和AR在男女ESCC患者组织中均有表达;男女ESCC患者表达水平在诊断年龄、高低发区、有无家族史、淋巴结有无转移及病理分期方面有差异;单因素生存分析显示:ERα、ERβ、PR和AR是影响ESCC患者预后的因素;Cox多因素生存分析显示:ERβ和AR是影响ESCC预后的独立危险因素;4.3 WES显示:男女ESCC患者体细胞突变数目比例无明显差异;碱基置换突变类型C>T/G>A,T>C/A>G,T>G/A>C的比例不同及突变特征Signature.1和Signature.17的不同可能是影响ESCC患者男女生存期不同的分子基础;P53和CDH1基因在男女ESCC患者中基因突变比例、点突变比例及6种碱基置换突变类型比例均无明显差异;P53基因突变与未突变ESCC患者生存期无明显差异,P53不同的突变类型可能与P53蛋白的阳性表达和生存期有关。