水稻线粒体不育基因RAPD标记筛选、克隆测序及特异性分析

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植物细胞质雄性不育(CMS)是植物遗传学研究热点之一,而水稻雄性不育是培育杂交水稻的理论基础。自1945年Sears提出植物雄性不育的“三型学说”以来,探索水稻的雄性不育基因已成为当前植物遗传学研究的焦点之一。水稻细胞质雄性不育(RCMS)是一种母性遗传性状,它是水稻杂种优势利用的一个重要途径。较多的研究结果表明,水稻细胞质雄性不育(RCMS)与线粒体基因组的关系十分密切,因此水稻线粒体基因组结构的分析对于揭示水稻细胞质雄性不育(RCMS)的分子机制具有十分重要的意义。本实验以研究报道较少的水稻印水型Ⅱ-32不育系、保持系、杂种一代为研究对象,通过RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术筛选其中的差异片段,并进一步验证其与不育性的关系。实验得到以下结果: 1.RAPD条件的优化 分别对Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物等设立浓度梯度实验(总体积为25μl),结果表明最佳的参数值为:Mg2+浓度为2.0mmol/l;dNTPs浓度为200μmol/l;Taq酶用量为1.5U;模板DNA浓度为0.5ng/μl;引物浓度为0.2μmol/l。 2.引物筛选的结果 共用OPERON公司260个随机引物(OPA~OPM)对Ⅱ-32A、Ⅱ-32B、Ⅱ优949进行扩增,除少数不产生扩增带外其余扩增效果较好。在分析统计多态性时,我们只考虑强带,共获得差异带22个。 3.差异片段OPJ18-1000、OPJ18-1400的回收和克隆 在水稻Ⅱ-32RAPD反应的优化条件下,用OPJ18扩增Ⅱ-32A、Ⅱ-32B及Ⅱ优949线粒体 水稻线粒体不育基因血皿标记筛边、克叵到序及特异住分析 DNA产生两条明显差异片段:0PJ18-1000、0卜J18-1400O 它们在11-32B线粒体洲A扩增条带相 应位置缺失,而在11-32A、11优949线粒体DNA扩增带中呈阳性。将0PJ18-1000、0PJ18-1400 回收后重组进pGEM-T easy vector。 4.序列测定和组织特异性分析 将所得含 0PJ18-1000、0PJ18-1400的重组质粒的全序列用 AB1377全自动测序仪测序。序 列测定两个特异片段全长分别为1068hP和1481hP。其己在GenBank上登录,登录号分别为: AY167748、AY167749。So[lthern杂交结果证明了差异片段的真实性。用 OPJ18-1000探针与 1132A、1132B、11优949的线粒体RNA斑点杂交,结果表明其在转录水平上对水稻雄性不育 有一定影响作用。虽然OPJ18-1400对应的RNA斑点杂交呈阴性,但其DNA序列中存在一个七碱 基5-TTCCCTC-3的保守系列,它是atp6基因中同源重组热点区,其促使线粒体基因重组形成嵌 合基因,从而对水稻雄性不育的形成起着重要作用。另外 0PJ18-1400 DNA序列同水稻染色体 1、 3、5、7、9、10有很高的同源性,分别为gi%(67V738)、92%(615/668)、92%(434/469)、 89%(665/743)、85%(627/730),除了说明水稻细胞质雄性不育与细胞核基因组也有一定的联 系外,也为研究水稻细胞质雄性不育提供了新思路。
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