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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称“单增李斯特菌”),在自然界分布广泛,能引起人和反刍动物的感染。作为食源性致病菌,可以通过污染多种食物而传播,如各种肉类、奶类、海产品等,人误食被污染的食品而感染李斯特菌病。 单增李斯特菌对环境应激具有较强的适应性,能够在宽泛的温度、低pH、低水活度以及高盐条件下存活。因为其拥有一套精密的抗应激调控机制,能够在遭遇环境变化时调控一系列抗应激基因的表达。Sigma B(σB)作为一种应激调控因子存在于不同种的革兰氏阳性菌,如单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌和葡萄球菌,在抗应激过程中发挥重要作用。σB抗应激调控网络在枯草芽孢杆菌中研究的较为透彻。枯草芽孢杆菌中σB的活力受到一系列Rsb蛋白的调控。这些Rsb蛋白中包含蛋白磷酸酶和磷酸激酶,整个调控渠道通过磷酸化和去磷酸化来实现。李斯特菌拥有与枯草芽孢杆菌类似的Rsb基因簇,但其对环境应激的调控机制研究尚浅。 本研究旨在:(1)利用单增李斯特菌rsbS缺失株,探究rsbS基因对单增李斯特菌抗盐应激的影响;(2)获得具有σB依赖型启动子和绿色荧光蛋白基因(gfp)融合的报告质粒,以探究单增李斯特菌应激环境中的σB活性;(3)探明rsbS基因在单增李斯特菌在盐应激条件下对SigB表达的调节。 研究结果表明:ΔrsbS在正常培养条件下的生长能力与野生株10403S相似,两者相比差异不显著,但ΔrsbS在5%NaC1应激条件下的生长能力却明显降低,且极显著低于野生株的生长能力(P<0.01),此外,ΔrsbS在高盐应激(15%NaCl)培养基中的存活率与野生株相比也存在着极显著的差异(P<0.01),提示RsbS介导该菌在盐应激环境中的生长能力和存活。在正常培养条件下,对ΔrsbS生物被膜和溶血溶脂特性进行检测,发现ΔrsbS的生物被膜形成能力与野生株相比,差异极显著(P<0.05),表明rsbS能够介导细菌生物被膜的形成,但不影响细菌的溶血和溶脂能力。 为了探究RsbS对单增李斯特菌抗应激过程中σB表达水平的影响,构建了携带σB依赖型启动子和gfp融合的报告质粒pERL3-PsigB-gfp,该报告质粒能够直接、准确地反应σB的表达水平。结果表明,盐应激一定时间后,ΔrsbS中检测到的GFP荧光值信号极显著低于野生株(P<0.01),进一步对细菌转录水平和蛋白水平进行检测,发现在ΔrsbS中几乎检测不到σB的表达,且ΔrsbS中σB的转录水平和蛋白水平均极显著低于野生株(P<0.01),提示rsbS能够显著介导应激环境中σB的激活,且rsbS能够正调控σB的表达。 本研究结果为更深入的探索单增李斯特菌σB操纵子的应激调控机制奠定基础。