一研究背景乳腺癌是严重危害女性健康的主要恶性肿瘤之一,近年来发病率有增高趋势。中国乳腺癌发病率较低,但却以年均3-4%的速度上升,远高于全球年均0.5%的上升速度。事实上,乳腺癌是一类分子水平上高度异质性的疾病,根据不同的分子特征(ER、PR、HER-2状态等)可将乳腺癌分成大致由4至5个亚群,即Luminal亚型(ER/PR+)、HER-2+(ER-,PR-,HER-2+)、Basal-like(ER-,PR-,HER-2-)和Normal-like等,而ER/PR+又分成LuminalA (HER-2-)和LuminalB(HER-2+)。 Luminal、HER-2+和Basal-like分别占65%～70%、10%和10%～15%。它们在临床治疗反应和生存方面截然不同。尤其是内分泌治疗,是乳腺癌辅助治疗的重要组成部分,与乳腺癌细胞的激素受体状态密切相关,ER与PR均阳性者有效率为60%～70%,ER或PR阳性有效率为30%～40%,两者均阴性有效率小于10%。因此内分泌治疗在乳腺癌治疗中的地位越来越受到人们的重视。其中PR是决定乳腺癌分子分型、预测预后和指导内分泌治疗的重要分子标志。然而,不同患者产生不同分子与病理类型乳腺癌的机理目前尚未明确,深入探讨乳腺癌不同分子分型可能存在的分子机制,对于临床上乳腺癌早期判断、及时诊治、判断内分泌治疗的疗效具有重要意义。成熟microRNAs (miRNAs)是一类长约22nt的内源性的非编码的单链微小RNA分子,能够特异靶向信使RNA (mRNA)并通过对mRNA剪切或转录后抑制的机制发挥重要的调节功能。通过与靶基因3’UTR完全或者不完全的匹配,miRNA可以降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻译.众多研究表明,当改变miRNA的表达水平时,它的很多靶基因的表达也会呈现出明显变化。目前普遍认为microRNAs参与的基因调控是遗传程序中最基本的一步,调控着细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能,它的异常表达与肿瘤相关的信号转导通路有密切联系。MicroRNA表达谱分析显示,在乳腺癌组织和正常组织之间,以及不同类型乳腺癌组织之间都存在特异性的microRNA标记。近年的研究表明,在乳腺癌中不同状态孕激素受体(PR)之间亦存在差异表达microRNAs,提示microRNAs可能参与PR(+)/PR(-)形成的调控过程。二、研究目的1.了解目前乳腺癌内分泌治疗相关基因的研究现状,以明确进一步研究与内分泌密切相关的分子分型的必要性。2.对PR (-)/PR(+)乳腺癌microRNAs差异表达谱进行生物信息学分析,探讨microRNAs在PR表达状态中可能参与的调控机制,为深入研究乳腺癌不同分子亚型的分化提供新思路。3.根据生物信息学预测所得结果,构建miRNA与靶基因的荧光素酶报告基因系统进行初步的实验验证,为进一步研究乳腺癌的分子分型提供实验依据。三、实验方法第一部分1.1文献检索选取Embase数据库、Medline/Pubmed数据库为检索数据库。Embase数据库进行Emtree扩展检索,辅以自由词的题目及摘要字段的检索；Pubmed/Medline数据库进行MeSH检索,辅以自由词的题目及摘要字段的检索。1.2文献计量分析采用Endnote X3软件对所检索文献管理,在此软件平台上完成文献纳入排除工作。用文献列表转换器将Endnote X3中的标注信息导出,对最终符合纳入标准的每篇文献分别进行出版年、国家、期刊、研究机构、作者进行统计。第二部分2.1数据挖掘：在数据库中,以"microRNAs"和“breast cancer"为任意词进行检索,纳入标准为“人类”及“临床样本”。对检索结果进行人工分析,筛选出相关文献及差异表达miRNAs集。2.2靶基因的预测及去重：利用Targetscan软件对各篇文献中挖掘所得的差异表达miRNAs集及各个miRNAs集的合集进行预测,得到多个靶基因集及靶基因合集。再利用DAVID数据库中的‘’Gene ID Conversion"功能模块对靶基因集去除重复基因。2.3靶基因集的两步富集：(Step1)以整个人类基因组为背景对照,利用DAVID数据库中"Functional Annotation Chart"功能模块下的"tissue_expression"工具对靶基因集中乳腺组织特异性表达的基因进行组织富集o (Step2)同样以人类基因组为背景对照,再利用"Functional Annotation Chart"功能模块下的基因本体论(Gene Ontology,GO)生物学过程(biological processes, BP)分类对经过组织特异性表达富集后的靶基因集进行GOBP分类富集,统计学显著性临界值取P≤0.05。2.4靶基因集的功能及通路分析：利用DAVID数据库中"Functional Annotation Chart"功能模块下的‘’GOTERM_BP_FAT’和"GOTERM_MF_FAT"功能对经过两步富集分析后的靶基因集分别进行GO生物学过程(BP)、GO分子功能(molecular function,MF)分析,再利用‘’KEGG_Pathways"和‘’BIOCARTA”分析功能进行信号和通路分析。统计学显著性临界值取P≤0.05。第三部分3.1靶向CARM1基因的miRNAs预测与筛选：根据第二部分生物信息学的结果,我们选择CARM1为研究对象,通过Pictar、Miranda、TargetScan初步预测作用于CARM1的所有microRNA,然后再对比第一部分中PR(+)/PR(-)乳腺癌差异表达microRNA表达谱中的miRNA,判断预测可能作用于CARM1的microRNA,再以筛选出的miRNA与CARM1为研究对象进行下一步实验验证。3.2携目的基因重组质粒的构建：设计并人工合成针对microRNA的CARM1目的基因片段并定向克隆到psiCHECK-2载体上,采用双酶切凝胶电泳与基因测序法鉴定重组载体psi-CHECK-2-CARM1-9与psi-CHECK-2-CARM1-103。3.3双荧光素酶报告基因系统的构建：将该重组质粒瞬时转染至Hela细胞后用双荧光报告检测系统进行荧光检测以确定miRNA与CARM1基因的靶向关系。四结果4.1第一部分乳腺癌内分泌治疗相关基因的研究正处于一个快速发展的阶段。美国是该领域相关研究最为活跃的国家。关注这一主题的文献逐渐增多,其中尤以Breast Cancer Research and Treatmen与Clinical Cancer Research期刊载文量为多。4.2第二部分通过文献挖掘找到3个差异表达microRNA数据集,生物信息学分析获得3个相应靶基因集和1个靶基因合集。靶基因的GO分类主要涉及细胞内的信号级联、蛋白氨基酸磷酸化、蛋白质甲基转移酶活性及转录因子活性等生物学过程及分子功能。通路分析发现3条KEGG信号通路和3条BIOCARTA代谢通路可能参与不同PR表达状态的调节。其中关键基因CARM1引起我们的注意。4.3第三部分双酶切凝胶电泳和基因测序鉴定重组质粒psi-CHECK-2-CARM1-9、 psi-CHECK-2-CARM1-103得到的产物片段及测序结果与预期一致。分别共转染miR-9minics与重组质粒psi-CHECK-2-CARM1-9、miR-103与psi-CHECK-CARM1-103至HeLa细胞中,其中miR-103与psi-CHECK-CARM1-103组的荧光素酶活性显著降低(P<0.01),比对照组(共转染miRNA minics与重组质粒control的HeLa细胞组)减弱了42.54%；五、结论1、乳腺癌内分泌治疗的研究越来越受到重视,但有关分子机制仍有待进一步研究。2、从生物信息学的角度初步分析了microRNAs在不同PR表达状态中可能参与调控的信号和代谢通路,为进一步实验探索microRNAs在乳腺癌不同分子亚型中的分化作用提供了思路。3、成功构建和鉴定携目的基因片段的psi-CHECK-2-CARM1-9、 psi-CHECK-2-CARM1-103的重组质粒,并通过荧光素酶报告基因系统证明了CARM1是miR-103的靶基因。