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目的:卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常见的高致死率的妇科恶性肿瘤,大约占全球3%的女性恶性肿瘤。由于起病隐匿,初期诊断困难,大多数患者来诊时已经处于癌症的中晚期,多数患者预后不良,5年生存率低。因此,探讨卵巢癌发病的深层机制,对寻找新的、有效的生物学指标和治疗靶点具有非常重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是近年来肿瘤学的研究热点之一,参与肿瘤细胞的增殖,迁移与侵袭、凋亡、化疗耐药、血管生成、免疫及成瘤等重要过程。膀胱癌相关转录因子1(bladder cancer associated transcript 1,BLACAT1)是新近报道的lncRNA,能够促进乳腺癌、宫颈癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、骨肉瘤以及胶质瘤等多种肿瘤的增殖和侵袭,然而其在卵巢癌中的作用尚未见报道。我们通过预测发现lncRNA BLACAT1上具有miR-519d-3p的结合位点,已有研究证实miR-519d-3p能够调控XIAP抑制卵巢癌细胞的增殖并增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。研究还发现miR-519d-3p能够抑制前列腺癌、胃癌、滋养层细胞以及胰腺癌等肿瘤细胞的增殖和侵袭,而其对卵巢癌侵袭、转移方面的作用及机制尚未见报道。多模态超声主要是指联合二维灰阶超声(2-Dimentional Ultrasound,2DUS)、彩色或能量多普勒超声(Color Doppler Flow Imagining,CDFI/Power Doppler Imagining,PDI)、超微血管显像(superb microvascular imaging,SMI)、超声造影(contrast-enhanced ultrasonography,CEUS)及超声弹性成像(Ultrasound elastography,UE),获取组织或病灶的相关声学参数,获得对病灶的形态学、血流灌注情况及组织硬度的全面的综合性评估,用于疾病的诊断、临床治疗的检测和疗效的评估,而目前对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤靶向基因治疗疗效的评估尚未见报道。方法:1.收集中国医科大学附属盛京医院(中国沈阳)妇科手术经病理证实的30例卵巢癌组织和同期29例正常卵巢组织,所有组织标本离体后在液氮中冷冻后于-80℃保存。全部患者术前均未接受过任何的放疗、化疗或激素治疗,也无任何其他系统的恶性肿瘤。同时,收集全部患者的相关临床病理资料。利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)方法检测临床样本组织和四种卵巢癌细胞株(SK-OV-3、ES-2、NIH-OVCAR-3、Caov-3)中BLACAT1的表达情况,分析其表达水平与卵巢癌患者的临床病理特征的相关性,并筛选出两种高表达的细胞株。2.将筛选出的SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞株分别分为对照组、NC shRNA组和BLACAT1 shRNA组,采用RNA干扰技术转染各组细胞,利用qRT-PCR技术检测敲减效果。利用MTT法及EdU染色法检测敲减BLACAT1的表达水平对卵巢癌细胞SK-OV-3、NIH-OVCAR-3增殖能力的影响;流式细胞术检验对细胞周期的影响;划痕实验和Transwell小室实验检验敲减BLACAT1后对SK-OV-3、NIH-OVCAR-3的迁移和侵袭能力的影响。3.将功能细胞HEK-293T分为四组:wt-BLACAT1+NC mimic组、mut-BLACAT1+NC mimic组、wt-BLACAT1+miR-519d-3p mimic组、mut-BLACAT1+miR-519d-3p mimic组,采用双荧光素酶检测BLACAT1与miR-519d-3p的结合情况。采用qRT-PCR技术检测敲减SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞中BLACAT1对miR-519d-3p表达水平的影响;采用Western blot检测敲减BLACAT1的SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞中RPS15A、总β-catenin、胞核β-catenin以及VEGF蛋白的表达水平。4.将SK-OV-3细胞分成为对照组、NC mimic组、miR-519d-3p mimic组,分别用miRNA的mimic转染SK-OV-3细胞,MTT法检验上调miR-519d-3p的表达对SK-OV-3细胞的增殖能力产生的影响;细胞划痕实验和Transwell小室实验检验上调miR-519d-3p的表达对SK-OV-3细胞迁移和侵袭能力产生的影响。5.采用BLACAT1 shRNA、NC shRNA分别转染SK-OV-3细胞并筛选稳转细胞株,将筛选的稳转卵巢癌细胞株接种于裸鼠右侧背部皮下,待成瘤后每三天测量并记录移植瘤的体积。于第25天将裸鼠处死之前行多模态超声检测(包括2DUS、CDFI、SMI和UE)。利用qRT-PCR方法检测瘤体组织中BLACAT1、miR-519d-3p的表达水平;Western blot检测瘤体组织中的RPS15A、总β-catenin、胞核β-catenin和VEGF蛋白的表达情况;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测瘤体组织中Ki67、CD31的表达情况,并统计微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:1.BLACAT1在卵巢癌病理组织中的表达量显著高于正常卵巢组织(P<0.05),卵巢癌组织中BLACAT1的表达量与卵巢癌组织的病理类型有关(P<0.05),其表达程度与患者的临床分期和淋巴结转移呈正相关(P<0.05),而与患者的年龄、肿瘤组织分期、血清CA125值、腹水情况以及肿瘤的大小无关(P>0.05)。四种卵巢细胞株中BLACAT1的表达均呈阳性,表达水平由高到低依次为SK-OV-3、NIH-OVCAR-3、ES-2、Caov-3,其中SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞株中的表达水平显著高于后两种(P<0.05)。2.shRNA-BLACAT1质粒能够成功的敲减SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞中BLACAT1的表达水平(P<0.05)。MTT实验、EdU染色及流式细胞术检测结果显示敲减卵巢癌细胞中BLACAT1的表达水平能够抑制SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞的增殖能力(P<0.05)。细胞划痕实验和Transwell小室实验结果表明敲减卵巢癌细胞中BLACAT1能够明显抑制SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞的迁移和侵袭行为(P<0.05)。3.利用网络在线生物信息学工具(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测发现BLACAT1和miR-519d-3p有靶向结合的位点,双荧光素酶实验结果显示,当293T细胞转染pmiR-GLO-wt-BLACAT1后,miR-519d-3p mimic能够明显减低其荧光素酶活性(P<0.05),而对转染pmiR-GLO-mut-BLACAT1的293T细胞的荧光素酶活性的影响不明显。qRT-PCR方法检测发现敲减BLACAT1能够显著上调SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞中miR-519d-3p的表达水平(P<0.05)。Western blot检测发现敲减SK-OV-3、NIH-OVCAR-3细胞中BLACAT1的表达能够显著降低细胞中RPS15A、胞核β-catenin和VEGF蛋白的表达(P<0.05),而对胞浆中总β-catenin蛋白的表达水平无显著影响(P>0.05)。4.MTT法检测结果发现上调miR-519d-3p的表达对SK-OV-3细胞的增殖具有抑制作用(P<0.05);细胞划痕实验和Transwell小室实验结果表明上调miR-519d-3p的表达可显著抑制SK-OV-3细胞的迁移和侵袭(P<0.05)。5.转染BLACAT1 shRNA的裸鼠皮下移植瘤(SK-OV-3)的生长速度和体积均显著低于转染NC shRNA组(P<0.05)。两组移植瘤的2DUS表现相似,无明显差异;CDFI联合SMI检测两组瘤体内的血流结果显示NC shRNA的血流多于BLACAT1 shRNA,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实时超声弹性成像(Real-Time Elastoechogenicity,RTE)检测两组瘤体评分都是以3分、4分为主,两组比较RTE结果差异无统计学意义(P>0.05);实时超声剪切波弹性成像技术(Shear wave elastography,SWE)结果证实NC shRNA组瘤体组织的Emax、Emean、Eratio测量值均高于BLACAT1 shRNA组,且两组比较有显著性差异(P<0.05)。qRT-PCR方法结果发现BLACAT1 shRNA组瘤体组织中BLACAT1的表达水平明显低于NC shRNA组,而miR-519d-3p的表达水平明显高于NC shRNA组(P<0.05)。Western Blot检测结果表明BLACAT1 shRNA组瘤体中RPS15A、胞核β-catenin及VEGF蛋白表达水平明显低于NC shRNA组(P<0.05),而两组的总β-catenin蛋白的表达无显著差异(P>0.05)。IHC结果证实BLACAT1shRNA组瘤体组织中的MVD和ki67均明显低于NC shRNA组,差异有统计学意义(P<0.05)。SMI血流半定量检查结果与MVD和VEGF蛋白的表达程度呈正相关。结论:1.BLACAT1在卵巢癌组织及细胞株中呈高水平表达,提示BLACAT1可能在卵巢癌的发生发展中发挥促癌基因的作用。2.BLACAT1可体外增强卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭的能力。3.BLACAT1能够通过靶向调控miR-519d-3p及其下游靶基因,进而激活Wnt/β-catenin信号通路促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭、转移,同时可能促进肿瘤组织的新生血管生成。4.miR-519d-3p在体外对卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力具有抑制作用。5.BLACAT1能够通过靶向调控miR-519d-3p及其下游靶基因,进而激活Wnt/β-catenin信号通路促进卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长和新生血管的生成。利用多模态超声(2DUS、CDFI、SMI、RTE、SWE)从肿瘤的形态、新生血管形成及组织硬度多方面验证BLACAT1shRNA对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的影响。