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前言肿瘤坏死因子样微弱诱导剂(TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK),作为TNF配体家族成员之一,为Ⅱ型跨膜蛋白,主要与细胞表面的TNF受体家族成员—Fn14(fibroblast growth factor inducible14)结合形成信号复合物来发挥广泛的生物学活性,如:介导细胞凋亡、诱导细胞的分化、移行和粘附,还可诱导内皮细胞增殖和血管形成。而目前发现的7种肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumornecrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)家族成员(TRAF1-7),作为一类重要的细胞衔接蛋白,能够与多种细胞表面受体的胞浆部分结合,参与多个细胞内信号转导通路的活化,包括NF-κB和JNK通路。这7种成员尽管都含有TRAF同源结构域,但是在信号转导过程中所起到的作用却不尽相同,其中以TRAF1最为特殊,因其不仅在正常组织中表达局限,而且是TRAFs家族中唯一不含有TRAFN端环指结构域的成员。目前,国内外关于TRAF1在信号通路中的作用及其作用方式存在不同看法:有些研究认为TRAF1在TNFR家族诱导的NF-κB活化中作为负性调控子存在;另外一些研究则表明,在细胞系中外源性转染TRAF1使之过表达可促进NF-κB活化。而且关于乳腺癌中TRAF1在TWEAK诱导的NF-κB活化中的作用研究,目前国内外未见报道。本实验主要利用免疫荧光检测几种不同乳腺癌细胞系中Fn14的表达情况,利用Western Blot和免疫共沉淀检测在rhTWEAK(重组人TWEAK)刺激下几种乳腺癌细胞系中TRAF1表达改变的情况,以及经过rhTWEAK刺激之后是否发生了NF-κ3信号通路的活化。材料与方法一、材料正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s。二、主要试剂和来源羊抗人多克隆anti-Fn14抗体(sc-27141)、鼠抗人单克隆anti-TRAF1抗体(sc-6253)鼠抗人单克隆anti-TRAF2抗体(sc-7346)均购自美国Santa Cruz公司。鼠抗人单克隆anti-Phospho-IκBα抗体(#9246)购自Cell signaling公司。人重组TWEAK(rhTWEAK)(#310-06)购自Peprotech公司。DAB酶底物显色试剂盒(ZLI-9032)和辣根酶标记第二抗体(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫共沉淀相关μColumns(Order No.130-042-701)和μMACS Protein GMicroBeads(Order No.130-071-101)购自德国Miltenyi Biotec公司。DMEM高糖、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自GIBCO公司。胰酶(Order No.27250018)购自美国Invitrogen公司。Western blot及IP细胞裂解液(Order No.P0013)购自碧云天生物技术研究所。三、方法1、应用免疫荧光方法检测Fn14在培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中的表达。2、应用Western blot方法检测经rhTWEAK刺激之后,培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中TRAF1表达改变的情况。3、应用免疫共沉淀方法检测经rhTWEAK刺激之后,培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中与TRAF2呈结合状态的TRAF1表达改变的情况。4、应用Western blot方法检测经rhTWEAK刺激之后,培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-κB信号通路的活化情况。5、应用SPSS12.0统计分析软件,对TRAF1在各细胞系中的表达量以及TRAF1与TRAF2在各细胞系中的结合量进行方差分析及其两两检验,p＜0.05为有统计学意义,p＜0.01为有显著统计学意义。结果1、免疫荧光方法检测Fn14在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌细胞系中的表达(1)在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中Fn14阳性表达。(2)在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-435s中未观察到Fn14的表达。2、Western blot方法检测经rhTWEAK刺激后TRAF1在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌细胞系中的表达(1)以不同浓度的rhTWEAK与三株细胞系分别孵育24h后收集细胞,经Western blot结果显示,Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中TRAF1呈浓度依赖性表达上调(p＜0.01),而Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1则呈浓度依赖性表达下调(p＜0.01)。(2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株细胞系分别孵育,按照设计的时间点收集细胞,经Western blot结果显示,Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中TRAF1呈时间依赖性表达上调(p＜0.01),而Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF1则呈时间依赖性表达下调(p＜0.01)。3、免疫共沉淀检测经rhTWEAK刺激后TRAF1和TRAF2在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌细胞系中的结合情况(1)TRAF1与TRAF2在MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-435s三种细胞系中均结合。(2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株细胞系分别孵育24h后收集细胞,与TRAF2呈结合状态的TRAF1在Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中表达明显上调(p＜0.01),而在Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中表达下调(p＜0.05)。4、Western blot方法检测经rhTWEAK刺激后乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s中NF-κB信号通路的活化情况(1)在MDA-MB-231中,经rhTWEAK刺激之后出现了短暂(15-30min)的I-κBα的磷酸化。(2)在MDA-MB-435s中则没有观察到一过性的I-κBα的磷酸化。结论1、Fn14在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中阳性表达,在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-435s中不表达。2、rhTWEAK对TRAF1的诱导作用表现为在Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中呈浓度和时间依赖性上调,而在Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中呈浓度和时间依赖性下调。3、rhTWEAK可以诱导Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中NF-κB信号通路的活化。以上结论提示在乳腺癌细胞系中,rhTWEAK对TRAF1的诱导作用可能是由Fn14介导的,且TRAF1可能通过与TRAF2的结合而发挥作用,这种方式在rhTWEAK诱导的NF-κB的活化中具有重要作用。