长期以来人工授精、精液冷冻保存和体外受精等动物繁殖技术对优良家畜牛、猪、羊和马的快速繁殖和品种改良发挥了重要作用,且对拯救濒危动物以及解决人类的不孕症亦都具有重要意义。广西是水牛养殖大省,随着农业机械化水平提高,水牛役用性价值逐年向肉用性和乳用性调整,广西水牛的品种改良也是水牛生产最重要的环节之一。水牛精液采集生产过程中发现,一些公牛个体的精子活率较低,无法用于水牛品种的杂交与改良。目前对有关影响水牛精子活率的基因及其调控机制研究较少,本研究在已有小鼠、人、牛等动物精子活率相关研究的基础上,初步研究了 PHB、CAPZB、TEKT2基因表达与水牛精子活率的关系。研究结果为进一步阐明这些基因在水牛精子发生过程中的作用及其对水牛精子活率的影响奠定了基础。研究结果如下:水牛PHB、CAPZB和TEKT2基因克隆与分析:以水牛睾丸组织为材料,参考黄牛相关基因序列,设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增获得了水牛PHB、CAPZB和TEKT2基因编码区片段。对克隆片段进行测序并分析,结果显示,水牛基因PHB 948 bp,包含819bp的ORF区,编码272个氨基酸;CAPZB基因958bp,包含906bp的ORF区,编码301个氨基酸;水牛TEKT2基因1449bp,包含1293bp的ORF区,编码430个氨基酸。多重序列比较分析结果显示,水牛与黄牛、野猪、羊、黑猩猩、人的PHB、CAPZB和TEKT2基因核苷酸序列相似性均高于90%。水牛CAPZB与黄牛、野猪、黑猩猩和人的氨基酸序列相似性为100%,与羊和小鼠的相似性为99%,显示其在进化上的高度保守性;水牛PHB和TEKT2氨基酸序列在不同物种亦具有高度保守性。系统进化树分析结果显示,PHB、CAPZB和TEKT2基因结果相似,水牛、黄牛和羊聚为一支,与生物学分类高度吻合。蛋白结构分析预测结果显示,水牛PHB、CAPZB和TEKT2蛋白的等电点分别为5.58、6.22和6.17,均为偏酸性蛋白质,3种蛋白均不存在信号肽序列,不是分泌型蛋白。细胞电子定位分析结果显示,PHB蛋白可能定位于精子的线粒体,CAPZB蛋白可能定位于定精子的细胞骨架,TEKT2蛋白可能定位于精子的细胞质。跨膜结构预测结果显示,PHB蛋白含有跨膜结构,CAPZB和TEKT2蛋白不含有跨膜结构。蛋白结构域特征分析结果显示,PHB蛋白存在结构域,CAPZB和TEKT2两个蛋白不存在结构域。PHB、CAPZB、TEKT2基因在水牛不同组织中的表达模式:QRT-PCR分析结果显示,PHB基因在水牛肾脏、肝脏、卵巢、睾丸、垂体中表达量较高,大脑中有一定的表达,在肌肉中表达量极低。CAPZB基因在水牛睾丸中相对表达量很高,显著高于在肾脏、卵巢、垂体和大脑等组织的表达(p<0.05)。TEKT2基因在水牛睾丸中高丰度表达,极显著高于肾脏、肝脏、卵巢、垂体和大脑组织中的表达,在肌肉几乎不表达(p<0.01)。免疫组化结果显示,PHB、CAPZB和TEKT2蛋白在水牛睾丸组织中均有表达,其中TEKT2蛋白表达量最高,其次为CAPZB,PHB蛋白表达量最低,免疫组化结果与QRT-PCR结果表达模式相似。PHB、CAPZB和TEKT2蛋白全部定位在水牛曲精小管上,主要富集在不同发育阶段的生精细胞上。高、低活率水牛精子显微结构观察:分别采集高活率水牛种公牛精液(活率达到0.74)、低活率种公牛精液(活率为0.37),两者活率差异显著(p<0.05)。透射电镜下观察发现,正常水牛精子由头、颈、尾三部分组成,头部呈椭圆形,尾部由中、主和末段组成;中段由轴丝及外周的线粒体鞘螺旋状包围而成,主段由纤维鞘环绕而成,中、主段的“9x2+2”结构清晰可见,末段轴丝仅由胞膜包裹。高活率水牛精子试验组具有完整精子结构且结构正常的精子数较多,精子尾部中央为9X2+2排列模式的轴丝;低活率试验组存在大量各种畸形精子,如双尾、卷尾、断尾、线粒体异常、核空泡化、顶体缺失、尾部中段中央2条微管缺失、死精子、头部异常等。水牛PHB、CAPZB和TEKT2基因表达水平与精子活率的关系:QRT-PCR分析结果显示,PHB基因在水牛高、低活率精子中具有不同程度的表达,在高活率精子中相对表达量(11.81±1.94)差异高于低活率精子(1.0±0.36),两者差异显著(P<0.05);CAPZB和TEKT2基因在高、低活率水牛精子中的表达亦差异显著(P<0.05),在高活率精子中的相对表达量显著高于低活率精子(P<0.05)。western-blot分析结果发现,高、低活率水牛精子样品的β-actin蛋白条带清晰一致,低活率精子样品的PHB、CAPZB和TEKT2蛋白表达均下调,这与mRNA水平的检测结果一致。结论:克隆得到的水牛PHB、CAPZB和TEKT2具有高度物种保守性,主要定位在曲精小管上,富集在不同发育阶段的生精细胞上,其表达量与精子的活率成高度正相关。