论文部分内容阅读
鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）属于黄病毒科黄病毒属的一种单股正链RNA病毒,主要引起雏鸭神经症状和蛋鸭产蛋下降。西尼罗河病毒（West Nile virus,WNV）和登革病毒（Dengue virus,DENV）等黄病毒在非结构蛋白5（non-structural protein 5,NS5）的N端含甲基转移酶（methyltransferase,MTase）结构域,催化病毒基因组N-7和2’-O甲基化在5’端形成I型帽子结构,促进病毒增殖。K61-D146-K182-E218催化四分体是黄病毒MTase高度保守的活性位点,然而K61-D146-K182-E218催化四分体点突变使2’-O甲基化丧失、N-7甲基化显著降低（其中D146位点突变会使N-7甲基化活性丧失）。DTMUV MTase的K61-D146-K182-E218对该病毒生物学特性研究尚未见报道。本文探究DTMUV MTase K61-D146-K182-E218对病毒增殖、毒力、翻译和宿主先天免疫影响,阐明病毒基因组5’端帽甲基化功能及其在病毒致病机理中作用,并进一步评估其突变DTMUV作为弱毒活疫苗候选株可行性。1.K61-D146-K182-E218点突变对DTMUV生物学特性的影响利用DTMUV复制子操作系统,成功构建K61A、D146A、K182A和E218A单点突变复制子,通过对复制子活性和拷贝数测定发现K61A、D146A、K182A和E218A点突变均能抑制DTMUV的复制能力。基于实验室构建的DTMUV全长感染性cDNA克隆,通过点突变成功拯救出K61A、D146A、K182A和E218A四株重组病毒株,研究表明K61A、K182A和E218A突变株遗传稳定,而D146A突变株在第3代发生回复突变。进一步探究表明,K61A、K182A和E218A点突变病毒的增殖能力（P＜0.05）和毒力（P＜0.05）均显著降低。2.K61A、K182A和E218A点突变对DTMUV翻译效率的影响病毒感染后10h、12h、14h和20h,三株点突变病毒（K61A、K182A和E218A）的病毒拷贝数没有降低、E蛋白表达量明显减少、病毒滴度显著降低,表明K61A、K182A和E218A点突变能降低DTMUV的翻译效率,从而减少了病毒的形成。用海肾荧光素酶基因替换DTMUV的开放阅读框并对RNA 5’端进行加帽修饰、N-7和2’-O甲基化修饰,将RNA转染DEF和BHK-21细胞后检测荧光素酶活性发现N-7甲基化的缺陷降低了DTMUV RNA的翻译效率,表明N-7甲基化的缺陷是导致K61A、K182A和E218A点突变DTMUV翻译效率降低的关键因素。3.K61A、K182A和E218A点突变DTMUV诱导先天免疫反应检测野生型（wild type,WT）病毒和K61A、K182A、E218A点突变病毒感染DEF细胞后细胞因子的表达水平,发现K61A突变病毒显著诱导IL-8和CCL5的表达,K182A突变病毒显著诱导MDA5、IFNβ、IFIT5和PKR的表达,E218A突变病毒显著诱导MDA5、IFNβ、IFIT5、IL-8和CCL5的表达,显示K61A、K182A和E218A点突变DTMUV能显著诱导宿主先天免疫反应。将E218A突变的DTMUV和WT DTMUV感染的细胞进行转录组测序。通过差异表达基因分析、GO和KEGG富集分析表明E218A突变病毒可能激活RIG-I样受体信号通路。进一步通过RT-qPCR及双荧光素酶报告试验测定发现E218A突变病毒显著诱导RIG-I样受体信号通路相关基因的表达,表明E218A突变的DTMUV能激活RIG-I样受体信号通路。4.K61A、K182A和E218A点突变DTMUV的免疫原性和免疫保护性研究将WT、K61A、K182A和E218A重组病毒以及商品化的DTMUV弱毒活疫苗WF100株免疫5日龄SPF雏鸭。结果表明K61A、K182A和E218A点突变病毒均不会引起雏鸭产生临床症状以及组织病理变化;三株点突变病毒组雏鸭的增重趋势与WF100疫苗组雏鸭的增重趋势一致。在免疫后2d、4d和6d,三株点突变病毒免疫组的血清病毒载量与WF100疫苗组的血清病毒载量相当且明显低于WT病毒免疫组的血清病毒载量。IFNγ和IL-4测定结果表明三株点突变病毒能够在免疫后21d诱导显著的细胞免疫反应。血清IgG抗体测定结果表明三株点突变病毒能够在免疫后28d诱导显著的体液免疫反应。攻毒保护结果发现,DMEM对照组鸭出现死亡,死亡率为14.3%,三株点突变病毒免疫组鸭全部存活。攻毒后4d,在三株点突变病毒免疫组鸭血清中未检测到病毒,而在WF100疫苗免疫组鸭血清中检测到约10~2拷贝数的病毒。攻毒后4d鸭脾脏组织的病理变化结果显示,点突变病毒免疫组鸭未引起组织病理变化,而DMEM对照组鸭出现红髓和白髓界限模糊,淋巴细胞变性、坏死。分析表明K61A、K182A和E218A点突变DTMUV单次免疫即可对雏鸭产生良好的保护力,具有作为DTMUV弱毒活疫苗候选株的潜力。综上所述,本文探究了K61-D146-K182-E218点突变对DTMUV生物学特性的影响,进而阐明了K61A、K182A和E218A点突变DTMUV的增殖能力和毒力减弱的原因,最后评估了K61A、K182A和E218A点突变DTMUV作为弱毒活疫苗候选株的可行性。