论文部分内容阅读
天然橡胶是世界上非常重要战略物资和工业原料,作为天然橡胶的主要来源,巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.,以下简称橡胶树）具有很高的经济价值。但是橡胶树资源非常有限,遗传上高度杂合,育种周期长、品种改良非常困难,因此迫切需要开发更有效的分子生物学方法来促进橡胶树遗传性状的改良。目前,CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRI-SPR associated protein 9）作为一种功能强大的靶向诱变工具,已在许多植物中实现基因的定点诱变,但迄今为止,研究CRISPR/Cas9技术在橡胶树中的应用尚未报道。在这里,我们描述了基于质粒的CRISPR/Cas9橡胶树基因组编辑方法和直接递送CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins（RNPs）在橡胶树中进行有效的定向诱变研究,精准靶向橡胶树2个FT（Flowering Locus T）和3个TFL1（Terminal Flower 1）基因,推动了橡胶树优质品种和高产速生特性的幼态化橡胶树的培育,推动力橡胶树精准育种技术创新的发展,并且为将来可以用于生产无外源DNA整合的基因组编辑橡胶树植株提供了可能。研究结果如下:1.构建了基于质粒的CRISPR/Cas9橡胶树基因组编辑体系:1.1编辑载体构建在橡胶树基因组数据库（hevea.catas.cn）中以拟南芥At U6-26和棉花Gh U6-9基因序列分析和筛选出具有高度同一性的5个Hb U6基因。然后扩增和测序Hb U6基因的启动子区域,克隆到五个启动子,分别为p Hb U6-1、p Hb U6-2、p Hb U6-3、p Hb U6-4和p Hb U6-5。在橡胶树基因组数据库内根据靶向橡胶树2个FT和3个TFL1基因筛选出高度特异的十个sg RNA靶序列,成功构建了以五个不同的p Hb U6启动子分别驱动靶向橡胶树基因Hb TFL1-3（T10）的CRISP/Cas9编辑载体和十个以p Hb U6-2启动子驱动靶向2个FT（Hb FT1、Hb FT2）和3个TFL1（Hb TFL1-1、Hb TFL1-2、Hb TFL1-3）基因的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。1.2编辑效率和类型分析靶向Hb TFL1-3（T10）基因由五个不同的pHb U6启动子驱动时,都实现了不同程度的诱导突变8.47%-24,92%,表明这5个不同的橡胶树内源性启动子p Hb U6能有效地驱动sg RNA的转录,并成功实现在橡胶树中对外源导入基因及内源基因的定点敲除,其中启动子p Hb U6-2和p Hb U6-4驱动的编辑效率最高,启动子p Hb U6-2序列最短,所以选择启动子p Hb U6-2作为后续实验的特定启动子。由p Hb U6-2启动子驱动靶向2个FT（Hb FT1、Hb FT2）和3个TFL1（Hb TFL1-1、Hb TFL1-2、Hb TFL1-3）基因时,靶向Hb TFL1-3（T10）基因的编辑效率最高;主要有缺失、插入和取代3种编辑类型,其编辑类型不相同,表明不同靶位点的编辑效率和类型不同。2.构建了基于非质粒的CRISPR/Cas9-sg RNA RNP橡胶树基因组编辑体系:2.1编辑体系将Cas9蛋白和体外转录sg RNA以不同的摩尔比组装靶向Hb TFL1-3（T10）基因,转化橡胶树原生质体,分析表明Cas9/sg RNA摩尔比为1:7可实现最高的编辑效率。选择五个特异的sg RNA序列分别靶向五个橡胶树FT/TFL1基因,将Cas9蛋白与体外转录sg RNA摩尔比1:7进行预组装,其中sg RNA包含单个sg RNA和按同等比例混合的多个sg RNA,然后转化橡胶树原生质体。2.2编辑效率和类型分析单个sgRNA诱导五个靶位点突变效率为3.74%-20.11%,表明都成功诱导了靶向突变;通过一个转化过程同时诱导多个靶向突变效率为1.26%-10.32%,表明多个靶位点同时成功诱导了突变,但是其突变率低于单个靶位点突变率;所有靶位点都有插入和缺失两种编辑类型,但是多个靶位点修饰与单个靶位点修饰的编辑类型相似但不完全一致,实现了在橡胶树原生质体中通过一个转化程序诱导了多个靶向突变。