Curli细胞分泌途径中重要蛋白的表达纯化及结构功能分析

来源 :中南林业科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liyanfeiwoshi
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淀粉样蛋白纤维(Amyloids)是一类错误折叠引发疾病的蛋白聚集体。近年来人们在细菌、真菌、蛛形钢动物、鱼和哺乳动物中发现了功能淀粉样蛋白纤维。Curli是一种典型的功能淀粉样纤维;在生物膜形成过程中,Curli是细胞外基质重要的组成部分,且具有调节细胞表面的吸附能力、细胞间相互作用和稳定三维结构、促使成熟的生物膜形成等重要功能。此外,Curli与一系列淀粉样疾病相关,如阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD),帕金森病(Parkinsons disease,PD),2型糖尿病(Type-2 diabetes)和肾功能衰竭等。  Curli是由富含β-折叠的高度有序蛋白亚基胞外聚集,形成4-7 nm宽无分支细长的一类具有功能的淀粉样蛋白。Curli是由CsgA和CsgB两种亚基组成,且每种亚基都含有5个重复的谷氨酸和天冬氨模体,均表现出淀粉样蛋白的生化特征。CsgE和CsgF是Curli分泌途径中两个重要的分子伴侣,周质空间的CsgE直接与CsgA相互作用防止其在周质空间过早聚集,在细胞外膜上的CsgF参与CsgB调控CsgA的聚合。CsgG蛋白是Curli分泌途径中镶嵌在外膜上的膜蛋白,与Curli亚基CsgA等转运至胞外密切相关。本研究以革兰氏阴性菌大肠杆菌CFT073为材料,以其基因组DNA为模板,通过分子克隆手段,克隆出Curli分泌途径中重要的三个基因:csgF、csgE、csgG;通过生物信息学分析三个基因,构建不同的重组质粒,研究其表达水平;通过研究CsgF、CsgE、CsgG三种蛋白的纯化条件,获取高纯化和稳定的蛋白表达纯化条件;通过蛋白结晶条件的研究,获得蛋白晶体并进行数据分析;通过蛋白的互作功能研究,获得蛋白之间功能关系。主要的研究结果如下:  1、Curli分泌系统中关键基因csgF的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础,成功构建了csgF重组表达质粒:pET-28a-CsgF-Full-C-6His、pET-28a-CsgF-nsp-N-6His、pET-28a-CsgF-nsp-C-6His、pET-28a-CsgF-(20-129)-C-6His;通过诱导条件优化,CsgF蛋白表达条件为:18℃、0.1 mmol/L IPTG诱导16-20 h;通过构建CsgF(20-129)截短体和纯化条件优化,CsgF(20-129)截短体稳定存在条件为:50 mmol/L醋酸钠、150 mmol/L NaCl、5% Glycerol。  2、Curli分泌系统中关键基因csgE的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础,成功构建了CsgE重组表达质粒成功的构建了pET-22b-CsgE-C-6His;通过诱导条件优化,CsgE蛋白表达在18℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导16-20 h条件下,成功使csgE基因在周质空间获得表达;通过对CsgE重组蛋白的纯化及条件优化,最后在25mmol/L Tris-HCl、pH7.0、150 mmol/L NaCl、5%glyercol中获得了稳定的高纯化的CsgE蛋白。  3、Curli分泌系统中关键基因csgG的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础,成功的将csgG基因克隆在pQLink-N表达载体上,获得了pQLink-N-CsgG-6His重组质粒;CsgG蛋白表达在18℃、0.1mmol/L IPTG、诱导16-20 h条件下获得表达;通过对CsgE重组蛋白的纯化及条件优化,最后在Buffer:25mmol/L Tris-HCl,pH7.0、150 mmol/L NaCl、5%glyercol、0.06% LDAO获得了稳定高纯化的CsgG蛋白。  4、CsgF、CsgE蛋白结晶分析及数据处理。开展了CsgF、CsgE蛋白晶体生长条件的筛选,成功的到了CsgE蛋白的晶体,CsgF未能获得晶体;通过对CsgE蛋白晶体的优化,最后在0.1 mol/L Imidazole、pH6.7、19.5% PEG6000条件下获得了大的菱形晶体;在上海同步辐射中心(SSFR)对CsgE蛋白晶体进行X-Ray衍射,获得了1套分辨率为2.3(A)的X-Ray数据;通过在线数据处理软件分析,确定CsgE蛋白晶体的空间群为:P42212,晶胞参数:a=72.992; b=72.992;c=81.279。  5、CsgF、CsgE和CsgG蛋白之间互作功能分析。体内融合表达csgE-csgG复合物,成功构建了pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-6His、pQLink-N-csgG-12GS-csgE-C-6His和pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-6His;将重组质粒转化到BL21菌中进行表达,通过Western blotting assay分析鉴定,并用镍柱亲和层析进行纯化,纯化后的融合蛋白CsgG-6GS-CsgE-C-6His进行聚集状态分析,发现融合蛋白主要以高聚的形式存在;进一步纯化CsgG-12GS-CsgE-C-6His、CsgG-14GS-CsgE-C-6His蛋白以及纯化条件的优化,均未能获得稳定的低聚融合蛋白;此外,开展体外重组的方式,分别将表达纯化好的CsgE、CsgF蛋白通过pull down试验,研究其与CsgG的互作;pull down试验结果表明CsgF、CsgE蛋白与CsgG蛋白均有相互作用。
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