【摘 要】
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茄尼基二磷酸合酶(solanesyl diphosphate synthase,SPS)不仅是质体醌-9侧链延伸的重要合成酶,而且还是茄尼醇合成过程中的关键酶。质体醌和茄尼醇在植物的生长发育和代谢调控上都发挥着重要的作用。其中,质体醌-9是光合作用中必不可少的氧化还原辅助因子,质体醌-9还在类胡萝卜素合成过程中参与调节八氢番茄红素脱氢酶的脱氢反应。类胡萝卜素在光合作用(photosynthesis
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茄尼基二磷酸合酶(solanesyl diphosphate synthase,SPS)不仅是质体醌-9侧链延伸的重要合成酶,而且还是茄尼醇合成过程中的关键酶。质体醌和茄尼醇在植物的生长发育和代谢调控上都发挥着重要的作用。其中,质体醌-9是光合作用中必不可少的氧化还原辅助因子,质体醌-9还在类胡萝卜素合成过程中参与调节八氢番茄红素脱氢酶的脱氢反应。类胡萝卜素在光合作用(photosynthesis)、光保护作用(photoprotection)及光形态的建成(photomorphogenesis)等植物生理方面发挥着重要作用。因此,SPS在植物光合作用、生长发育和生理代谢起着不可或缺的功能。本研究利用遗传学、生物化学和生物信息学等技术方法阐明了GhSPS1/2参与质体醌-9合成,解析其通过质体醌-9合成和积累以淬灭单线态氧,从而影响植株的生长发育,主要的研究结果如下:1、为了研究SPS在双子叶中的功能,我们在棉花(Gossypium hirsutum)中鉴定出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)At SPS1/At SPS2的直系同源基因GhSPS1/Gh SPS2。通过病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)技术抑制GhSPS1/SPS2表达,结果显示,TRV:GhSPS1/SPS2沉默植株叶片出现了白化和生长发育缓慢等表型。2、对TRV:GhSPS1/SPS2沉默植株和对照的质体醌、类胡萝卜素、叶绿素和维生素E(生育酚)等相关代谢产物含量进行检测,结果显示,在TRV:GhSPS1/2的棉花植株中质体醌、类胡萝卜素、叶绿素和维生素E含量与对照组相比较分别下降了65%、46%、66%和10.6%。同时也检测了沉默植株中单线态氧(~1O2)含量,发现其与对照相比上升了58%。并发现基因沉默棉花植株的质体醌含量下降与光合效率降低是一致的。3、利用基因编辑技术对GhSPS1/2进行基因敲除,获得了棉花编辑突变体,突变体的白化表型比病毒诱导基因沉默的白化表型更明显,这可能归咎于病毒诱导基因沉默(VIGS)技术不能完全沉默靶基因的表达所导致的结果。同时,对基因编辑的棉花进行了质体醌和~1O2含量检测,结果显示,在棉花中质体醌含量下降了64%,并且~1O2的含量上升了125%,质体醌含量的下降伴随~1O2含量的上升,这种趋势变化和TRV:GhSPS1一致。再次证明了GhSPS1/2参与棉花质体醌-9合成以淬灭单线态氧。4、为了进一步揭示GhSPS1/2调控~1O2含量的调控机制,进行了蛋白互作分析,通过对棉花基因酵母文库进行筛选,获得两个与GhSPS1相互作用的蛋白,即GhPsbO和GhCAB-151。并对两个蛋白编码的基因进行VIGS获得相应的基因沉默植株。结果显示,TRV:GhPsbO在叶脉处出现明显白色纹路的表型,质体醌含量下降了18%,此外,TRV:GhPsbO中~1O2含量上升了11.5%。TRV:GhCAB-151植株表型、质体醌和~1O2含量与对照均无明显变化。根据已有报道我们虽不能证明质体醌可能在叶绿体包膜和质体小球中向类囊体膜中进行迁移来补充类囊体中质体醌的消耗,但我们首次证明GhPsbO可能协同GhSPS1参与调控在棉花类囊体中质体醌的合成,而GhCAB-151可能不参与此过程。5.为了探究GhSPS1/2在植物种的调控~1O2含量的功能是否保守,本研究也鉴定出烟草(Nicotiana tobacum)Nt SPS1/SPS1-LIKE和拟南芥(Arabidopsis thaliana)At SPS1/SPS2进行与棉花类似的研究。通过VIGS技术进行基因沉默获得的TRV:Nt SPS1/SPS1-LIKE沉默植株也出现了白化表型。同时沉默At SPS1和At SPS2植株质体醌含量与对照相比也下降了56%。利用基因编辑技术对Nt SPS1/SPS1-LIKE进行基因敲除,烟草幼苗编辑突变体的白化表型也显著高于病毒诱导的基因沉默植株的表型。基因编辑烟草突变体植株中质体醌含量相比对照下降了83.2%,~1O2含量上升了211%。这些结果证明了SPS1/2在植物中的功能存在着保守性。
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