脱落酸(Abscisic acid,ABA)参与植物发育和生物及非生物胁迫响应等关键生理过程调控,其通过脱落酸受体PYL和2C型蛋白磷酸酶(PP2Cs)进行信号转导。当ABA存在时,PYL结合ABA之后可以抑制PP2C的活性,导致蛋白激酶SnRK2s的活性得到释放,磷酸化激活下游的转录因子DFs,引起一系列对ABA的反应。依据脱落酸信号传导机制,本研究选取水稻日本晴脱落酸受体PYL2和2C型蛋白磷酸酶PP2C06两个蛋白,采用发光效率高的荧光素酶(Nano-luciferase,Nluc)和荧光量子产率高的单体黄绿色荧光蛋白(mNeon Green),与其N端和C端依次融合,得到八个融合蛋白。基于依赖脱落酸介导的脱落酸受体PYL与蛋白磷酸酶PP2C相互作用,使能量供体与能量受体的空间距离达到能量转移的临界距离,从而产生BRET信号,建立脱落酸BRET检测新方法。主要工作如下:1.BRET信号模块的构建。构建pET28a-mNeonGreen-PYL2,pET28a-PYL2-mNeonGreen,pET28a-Nluc-PP2C,pET28a-PP2C-Nluc,pET28a-mNeonGreen-PP2C,pET28a-PP2C-mNeonGreen,pET28a-Nluc-PYL2,pET28a-PYL2-Nluc八个重组载体。以大肠杆菌BL21为宿主菌,进行八个融合蛋白表达,HIS柱纯化后,SDS-PAGE分析蛋白表达纯化结果,并采用紫外、荧光及生物发光技术鉴定八个蛋白的光谱特征。将所得供体蛋白和受体蛋白两两组合优化BRET信号模块,得到生物发光效率最高的BRET信号模块组合mNeonGreen-PYL2和Nluc-PP2C。2.BRET检测体系的优化:盐离子浓度,BSA浓度以及能量供体和能量受体的浓度比例进行优化。结果:体系增加盐离子浓度和BSA浓度会抑制BRET,能量供体和能量受体浓度比为1:6时,该体系具有最高的能量转移效率。利用最优的BRET体系检测脱落酸,检测的线性范围为0.005~0.1μM,线性回归方程y=0.53344x+0.06597(R2=0.88632),检测限(LOD)3.8 nM,并考察了BRET体系对脱落酸的专一性。最后将该体系应用于干旱和正常水稻叶片样品的脱落酸含量检测,并与质谱法的检测结果对比。结果发现BRET定量结果:干旱水稻叶片ABA含量为4.9150 ng/g,正常水稻叶片ABA含量为3.3168 ng/g,质谱定量结果:干旱水稻叶片ABA含量为12.724 ng/g,正常水稻叶片ABA含量12.678 n/g。表明该BRET生物传感方法成功建立,可用于实际样品中脱落酸的检测。3.基于PYL2-mNeonGreen的荧光特性及专一特性建立脱落酸的荧光检测方法。构建pET28a-PYL2-mNeonGreen和pET28a-mNeonGreen两个重组载体,以大肠杆菌BL21为宿主菌,蛋白质表达,HIS纯化,SDS-PAGE鉴定结果。加入脱落酸后,融合蛋白PYL2-mNeonGreen荧光强度逐渐降低,去除mNeonGreen自身荧光光漂白所引起的背景值,得到由ABA与融合蛋白PYL2-mNeonGreen结合引起的荧光强度净变化值,y=0.02679x+0.04728(R2=0.9978),检测线(LOD)0.04728μM,可用于ABA的定量检测。