MicroRNAs(miRNAs)是一类非蛋白编码的短小的内源性RNAs,是重要的基因表达的后转录调节因子,它在细胞发育、新陈代谢、细胞凋亡和肿瘤的发生等生物过程中都起着至关重要的作用。核酸扩增检测技术主要是通过生成大量的目标物的复制序列或者是将目标物转化为其他的特殊的核酸序列或信号分子,达到扩增检测目标物的目的。目标物或信号的扩增过程致使该检测技术具有较高的灵敏度和选择性。然而,大多核酸扩增检测技术的实验设计复杂,不便于操作,而且荧光标记探针和特殊的DNA或RNA酶的使用大大增加了检测成本,这限制了它们的应用范围。因此,迫切需要研发新的经济方便、灵敏度高且选择性好的miRNA检测方法。本论文致力于研究基于聚合酶的核酸扩增检测技术,主要设计了一系列简单、快速、灵敏且经济的miRNA检测新方法,为癌症的早期诊断、介入治疗以及抗癌药物的发现提供了研究基础。主要研究内容如下:1、围绕本论文的研究内容,对miRNAs、末端脱氧核苷酸转移酶(TdTase)和用于miRNA检测的核酸扩增技术进行了综述。首先,对miRNAs的起源、作用机制和生物学功能进行了总结,并着重论述了miRNAs在细胞发育、细胞分化以及在免疫系统、癌症和作为致癌基因或抑癌基因方面的重要作用和意义。然后,简要介绍了DNA聚合酶的重要性和分类,着重论述了TdTase聚合酶的活性分析。最后,综述了几种常用的miRNA核酸扩增检测技术,包括聚合酶链反应扩增检测技术、滚环扩增检测技术、链置换扩增检测技术、双链特异性酶扩增检测技术以及杂交链反应扩增检测技术等。2、提出一种新颖简单通用的分支级联酶扩增(branched cascade enzymatic amplification,BCEA)技术,旨在通过目标miRNA和捕获探针DNA的直接杂交启动聚合酶的催化反应,并通过第二引物的引入产生大量的双链分支进而提高扩增效率,利用SYBR Green?(SG)作为荧光信号对miRNAs进行定量检测。本方法中SG的荧光强度随目标miRNA浓度(1 fM-10 pM)的增加呈指数扩增,对miRNA的检测下限为0.1 fM。本方法不仅可以有效区分miRNAs之间的单碱基错配,还可以直接用于癌症细胞提取物中mi RNAs的灵敏检测。本方法的优势在于:首先,降低了实验操作的复杂性和分析成本;其次,对mi RNAs的检测限非常低且选择性高,并可直接用于癌症细胞提取物中mirnas的高灵敏检测,在临床诊断中具有很大的应用潜力;最后,本文提出的beca方法简单、扩增效率高且通用性好,可拓展应用于其他传感技术。3、发展一种基于hg2+辅助的双聚合酶等温核酸扩增技术(hg2+-assistantdualpolymeraseisothermalnucleicacidamplification,hg2+-dpina)的mirna检测方法。目标mirna与模板dna杂交,然后在klenow片段和tdtase两种聚合酶的作用下催化生成聚t碱基序列,加入hg2+形成t-hg2+-t双链结构,sg荧光染料可插入到此双链结构中使sg的荧光显著增强,而sg荧光增强的程度与mirnas的浓度呈正相关,据此实现mirnas的灵敏检测。本方法对mirnas检测的线性范围为10pm-10nm,其检测下限为5pm。本方法的优势在于:首先,hg2+的引入可以直接形成t-hg2+-t双链结构,避免了因杂交引起的错配或发生链置换反应,提高了双链的结合效率;其次,本方法采用的“turn-on”模式可有效提高检测灵敏度和减少假阳性信号;最后,本方法可用于识别检测细胞溶解产物中的mirna序列,具有良好的实际应用价值。4、将双聚合酶催化延伸胸腺嘧啶(enzymaticallyengineeredprimerextensionpoly-thymine,epept)机制与纳米材料的原位生成技术相结合,发展了一种以聚胸腺嘧啶为模板原位生成荧光cunps的mirna检测方法。本方法基于聚合酶klenow片段和tdtase的共同催化作用,将mirna与模板dna杂交后有效延伸成长度较长的聚胸腺嘧啶序列,加入cu2+和抗坏血酸钠,即以此聚胸腺嘧啶序列为模板原位生成红色荧光的polyt-cunps,polyt-cunps的荧光强度与mirna浓度的对数成正比,据此实现mirnas的低背景和高灵敏检测。本方法对mirna检测的线性范围为1pm-1nm,检测下限为100fm,应用于多种细胞溶解产物中mirnas的检测,获得满意结果。此外,由于本方法生成的polyt-cunps可发射强红色荧光并具有良好的stokes位移,因此在紫外灯照射下可以实现mirnas的可视化检测,在荧光成像、临床诊断和生物化学分析等领域具有广阔的应用前景。5、将富g碱基序列与tb3+之间的共振能量转移效应应用于mirna检测中,提出一种新颖的基于稀土离子荧光增强的mirna分析方法,并用于复杂样品中mirnas的良好检测。利用配体敏化tb3+优良的stokes位移和强而尖锐的发射光谱等光学性质,构建基于富鸟嘌呤dna敏化tb3+荧光检测mirnas的方法。首先由目标miRNA诱导启动聚合反应,通过两个聚合酶的联合作用,生成大量的长链富G碱基DNA序列,富G碱基DNA序列通过共振能量转移效应增强Tb3+的荧光。随着目标miRNA浓度的增加(0-1 nM),Tb3+在545 nm处的荧光发射光谱强度逐渐增强,据此可实现对miRNAs的检测,检测下限为100 fM。在以上基础上,建立了基于Tb3+和半导体QDs双发射比率荧光传感平台用于miRNAs的灵敏检测。先利用偶联技术将QDs与捕获探针pDNA耦合形成QDs-pDNA复合物,并以QDs的荧光发射峰为内参比荧光,目标miRNA诱导启动聚合反应生成大量的长链富G碱基DNA序列,并增强Tb3+的荧光强度,根据Tb3+和半导体QDs的荧光强度比值(I545/I610)可实现miRNAs的宽范围和灵敏检测。双信号比率荧光传感技术中的内参比荧光保持不变,可以避免样品环境、仪器和人工操作等外界因素对实验的影响。