DNA作为最重要的遗传物质，一直以来受到遗传学和基因工程研究的关注。通过DNA的人工操作和导入进行的基因治疗和核酸疫苗，也是医学遗传学范畴下的重要研究领域之一。然而，大量前期实践证实，人体的基因治疗和核酸疫苗的效果并不理想，并与小鼠等模式生物中的研究结果差别很大。这部分提示了人体内可能存在限制DNA导入和基因治疗的某些机制，从而影响了目前DNA介导的基因治疗的发展。针对这些抑制性机制进行研究，无疑对于基因治疗和核酸疫苗的发展具有重要意义。　　 近年来研究表明，DNA也是人体免疫系统识别和清除的重要成分。外源性的核酸物质，包括感染病原体的核酸组分，人工合成的核酸片段和模拟分子等，还是内源性的核酸物质，包括人体自身的体液循环核酸，细胞凋亡小体内的DNA片段等，均可以成为免疫系统的识别对象，并引起强烈的先天免疫反应和抗原特异性免疫反应。在临床疾病方面，DNA免疫识别的异常可以引起SLE，干燥综合症，银屑病等多种自身免疫性疾病，而另一方面，DNA作为一种免疫调节剂，在肿瘤，感染性疾病中早有应用，而携带特定基因的DNA载体，又在DNA疫苗和基因治疗领域有着广泛的应用。因此，研究DNA的免疫识别机制，不仅可以对免疫和炎症相关疾病的发病机制有着更深层次的认识，更可以为DNA佐剂和DNA为基础的基因疫苗和基因治疗研究增加理论基础，并为其应用研究开拓新的方向。　　 基于以上背景，本论文从以下几个方面进行了研究:　　 第一部分：胞外DNA结合蛋白SAP对DNA先天免疫识别的调控机制研究　　 我们首先根据人和小鼠对DNA反应性的显著物种差别，提出了人体内可能特异性存在某些DNA清除及负向调控分子的假设。通过DNA结合蛋白质免疫沉淀偶联质谱鉴定的技术筛选了人和小鼠的差异性DNA结合蛋白，结果发现，人血清中主要的DNA结合蛋白为血清淀粉样蛋白P物质(SAP)，而小鼠中不存在结合DNA的SAP蛋白。经过采用Dot-EIA和EMSA对SAP DNA结合活性的验证，证实了SAP是主要的物种差异性DNA结合蛋白。SAP结合DNA不依赖于DNA大小，构象和结构，并且可以被一种SAP抑制剂CHPHC通过改变其天然五聚体结构而破坏。　　 我们进一步探讨了SAP结合DNA后对DNA降解，DNA入胞等生理过程的影响。我们发现了SAP可以促进DNA被人和小鼠巨噬细胞吞噬,而且这种吞噬的效率很高，吞噬的DNA定位于早期内体，但未在晚期内体分布，且降解迅速，降解过程可以被氯喹阻断，提示DNA吞噬后进入早期内体，并在内体酸化过程中降解。进一步研究发现DNA在无SAP存在的情况下，主要是通过胞巨饮途径摄取，且依赖分子主要为HMGBl, LL37等，而SAP存在下主要通过受体介导的胞吞途径，且主要的依赖受体为Fcγ受体(FcγRs)和清道夫受体。SAP可以对HMGB1, LL37等分子有竞争性抑制作用。因此，我们提出了SAP可以改变DNA的摄取途径和DNA的胞内代谢过程，抑制DNA进入胞浆的转染过程而促进其在内体中的降解。　　 随后，我们探讨了SAP介导的DNA入胞对DNA先天免疫识别的影响。SAP可以显著地抑制DNA诱导的巨噬细胞激活，表现为细胞因子和趋化因子分泌大大减少，而且可以抑制TLR9下游的NF-κB, RIG-Ⅰ、DAI下游的IRF3转录因子的激活。为了探讨SAP的抑制DNA免疫功能在正常生理条件下有无意义，我们在体内外模拟正常人生理环境进行研究，采用SAP的抑制剂CHPHC进行干预后以DNA进行刺激。结果发现SAP生理条件下可以抑制DNA诱导的免疫激活，而CHPHC处理可以消除SAP的抑制作用，恢复DNA诱导的先天免疫反应。这充分提示了SAP对先天免疫反应的负向调控作用及其生理意义。　　 第二部分:SAP对DNA先天免疫识别的影响机制在核酸疫苗和肝脏疾病领域中的应用研究　　 核酸疫苗是重要的新型疫苗，但是其免疫效力在人体实验中很不理想，且其机制尚不明确。鉴于SAP的上述对于SAP与DNA转染和DNA先天免疫激活的关系，我们设想SAP可能是限制核酸疫苗体内免疫效力的关键性因素。我们首先通过疫苗按种组织的病理学研究证明了SAP在接种肌肉，引流淋巴结均有分布。在体内研究中，我们首先采用了人SAP和DNA的复合物联合注射的策略，验证了SAP对DNA免疫原性的影响;随后构建了人SAP转基因小鼠模型，进一步研究在转基因小鼠上验证了DNA疫苗免疫原性下降的现象。进一步采用SAP抑制剂CHPHC作为佐剂，发现DNA疫苗的免疫原性显著提高。进行综合上述理论，我们提出了SAP在人类接种核酸疫苗中可能使得部分核酸疫苗被火活，抑制其活性，是一种针对外源核酸物质的防御机制的假设。CHPHC作为SAP抑制剂，有可能有力地改善核酸疫苗的免疫效力。　　 肝脏炎症和肝癌研究存在着重大的临床意义。但是肝脏炎症，肝细胞再生及肝癌发生之问的相互关系仍然是扑朔迷离。我们设想了细菌和病毒来源的DNA可能对于肝脏内的先天免疫激活有着重要意义，研究发现肝细胞内存在着DNA的识别受体RIG-Ⅰ，并且DNA可以跨膜进入肝细胞，激活RIG-Ⅰ下游的IRF3信号分子。这一摄取过程也与SAP的存在有关。这一机制对于细菌成分和DNA病毒引起的肝脏炎症机制有着重要的意义。我们还进一步发现HBxAg对SAP介导的DNA识别具有抑制性作用，并对HBxAg诱导的基因表达改变进行了系统性分析，这些机制在肝炎发生发展中可能具有重要意义。在肝癌研究中，我们也发现了SAP在肝癌微环境中的聚集现象，提示了SAP介导的DNA先天免疫激活对肝癌和肿瘤炎性微环境中的可能意义。　　 总之，本研究从细胞外的DNA结合蛋白及DNA诱导的宿主系统性反应入手，对DNA的入胞过程和先天免疫激活负向调控机制反应进行了系统研究，提出了DNA免疫识别的pass or arrest假说。我们认为细胞外存在着DNA的抑制性调控分子，并证实SAP可能是其中的关键成分，并且具有物种差异性。当SAP以较高浓度存在于细胞外环境时，DNA被SAP所结合并抑制其免疫激活属性，即SAP"arrest"DNA；而当某些环境下HMGB1及LL37等蛋白分泌增多，DNA可以被其携带，穿过即"pass"SAP屏障并进一步被先天免疫细胞尤其是巨噬细胞和DC细胞识别。该假说系统地分析了DNA免疫识别的细胞外蛋白调控机制。我们进一步探讨了这一机制在核酸疫苗免疫，肝脏炎症反应和肝癌微环境中的意义，重点探讨了SAP蛋白对核酸疫苗活性的影响及其重要意义，提出了SAP可能是限制人类核酸疫苗免疫效力的因素之一。研究拓展了对DNA免疫识别机制的调控网络的认识，并为治疗性核酸疫苗，肝炎和肝再生，肝癌等领域提供了新的研究方向。