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背景和目的：恶性肿瘤是危及生命的人类重大疾病之一。目前除干扰素外,临床上可使用的抗病毒药物抗病毒谱较窄并可诱导病毒耐药[9-10]。抗菌肽(antibacterial-peptide)是广泛存在于多种低等生物尤其是昆虫体内的短肽类物质,有抵御外界微生物侵害、清除体内突变细胞作用的一类小分子多肽[3-7]。Alloferon-1是Chemysh等(2002)从昆虫Calliphora vicina血液中发现的一种新型抗菌肽,体外试验结果表明,Alloferon-1可使小鼠脾脏内NK细胞活力显著增加,并促进干扰素(IFN)的合成与分泌。此外,针对肺部感染了致死剂量的人甲型和乙型流感病毒的小鼠,Alloferon-1可显著地提高其存活率[1]。鉴于Alloferon-1分子量小(13肽)而难以诱生抗体、抗病毒和抗肿瘤效果明确、低剂量即能激活免疫系统的反应(μg级)等优点,故认为Alloferon-1较之其它抗菌肽,有更为明确的应用前景和优势,将进一步发展成为既抗肿瘤又抗病毒的新型多肽类药物。本研究中,我们设计构建了串联表达14个以胰蛋白酶酶切位点赖氨酸连接的Alloferon-1原核表达系统,通过对比重组表达的含赖氨酸尾巴的Alloferon-1及化学合成的Alloferon-1的体外抗肿瘤细胞活性,对重组Alloferon-1的生物学活性进行了检测和研究。
实验方法：根据Alloferon-1氨基酸序列中不含精氨酸和赖氨酸的特点,将串联表达的Alloferon-1设计为用胰蛋白酶切割。先设计合成一对交错互补的单链DNA,内含一个Alloferon-1基因和一个赖氨酸密码子(Alloferon-1-K基因),在此基础上再利用DNA复性的原理使其聚合成不同长度串联的Alloferon-1-K双链DNA。将复性后串联的Alloferon-1-K双链DNA上的缺口用T4 DNA连接酶修补后,再在PCR反应体系中使串联的Alloferon-1.K双链DNA两端的单链补齐,并在两端连上A尾巴,然后将其克隆到T载体上;获得的阳性单克隆菌落经测序鉴定检测,选取插入有14×Alloferon-1-K基因T载体的单克隆并纯化其中的质粒DNA作为PCR模板,采用常规的分子生物学方法构建生产14× Alloferon-1-K的原核表达系统;采用SDS-PAGE分析14×Alloferon-1-K的表达情况和产量;采用Ni-NTA亲和层析、胰蛋白酶酶切和Sephadex G-50层析法提纯14×Alloferon-1-K及Alloferon-1-K单体;向混合有BALB/c小鼠脾细胞的K562、KB和SGC肿瘤细胞中分别加入重组的Alloferon-1-K、化学合成的Alloferon-1-K及Alloferon-1,采用CCK-8法检测对比体外抑制肿瘤细胞的活性。
结果：成功构建了含14×Alloferon-1-K基因的原核表达系统pET42a-14×Alloferon-1-K E.coli BL21(DE3)。在IPTG诱导下,该菌株表达的重组蛋白(14×Alloferon-1-K)产量约为细菌总蛋白的30％。获得的重组Alloferon-1-K单体,体外抗肿瘤生物学活性分析显示:在0.1 ng-10ng/ml的范围内有明显的抑制K562、KB和SGC肿瘤细胞生长及增殖的生物学活性(P＜0.01),对照化学合成的Alloferon-1、Alloferon-1-K的抑制作用,三者间无明显差异(P＞0.05)。
结论：本研究构建成功了含14× Alloferon-1-K基因的原核表达系统,重组表达的Alloferon-1-K单体与化学合成的Alloferon-1、Alloferon-1-K具有相同的体外抗肿瘤细胞生物学活性。