研究意义人体的骨骼系统具有维持运动、保护体内脏器、支撑体重等重要功能,创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因。保守估计,美国每年消耗数千亿美元用于治疗各种原因导致的骨缺损。我国每年也有众多患者需要进行骨移植手术,消耗惊人。目前自体骨移植、异体骨移植和人工合成骨填充是临床常见的骨组织替代修复方法,自体骨移植是目前临床最常用的治疗方法,也同时被认为是治疗骨缺损的金标准,自体骨移植具有其他两种替代材料无法比拟的优点,如无排斥反应、无污染、材料成本低、可完全吸收、有效诱导骨重建；而异体骨来源则较自体骨丰富,免疫源性低,可提供结构支撑等优点。但这些治疗方法仍存在很多不足,自体骨移植供骨量少、需要额外的取骨手术部位而相应地增加了麻醉及手术的时间、并发症相对较高、取骨部位长时间疼痛不适等；异体骨存在来源问题,可能导致疾病传染,免疫排斥反应,人工合成骨填充材料目前仍旧只能起到骨缺损填充及支持作用,不能有效地诱导自体骨生长。常用的人工骨有磷酸钙骨水泥及丙烯酸酯类骨水泥,但二者在组织相容性、机械强度、骨传导性方面的平衡仍无法完全满足临床需要,因此,如何更好的修复骨组织缺损,一直是修复重建研究领域的热点之一。近年来,关于生物材料的研究,新型骨移植材料、骨生物工程学的研究与应用,逐渐成为骨科领域的热点研究问题之一。材料支架是骨组织工程生物材料的核心元素,各种支架可根据骨缺损形态需要成型,作为连接细胞和组织的框架,引导组织生长成特定形态,同时起到机械支撑作用,抵抗外来的压力,为细胞提供繁殖分化和新陈代谢的场所。随着材料工艺的不断进步,支架材料的研究也日趋丰富。目前研究较多的支架材料有磷酸钙骨水泥(CPC)、磷酸三钙复合物(TCP)、聚已内酯(PCL)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等,各种支架材料都在成骨等方面有着不同的表现。体外构建与天然骨成分、结构相似的骨生物替代材料,被认为是解决目前各种骨组织填充材料不足的有效方法之一。磷酸三钙(TCP)则是人体骨骼常见成分,生物材料中最常用的是p-磷酸三钙(p-TCP),其具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性,是理想的人体硬组织修复和替代材料。目前β-TCP已广泛应用于骨科、口腔科的组织修复中。目前相关骨组织工程基础研究,已形成了比较丰富的联合种子细胞、生物活性因子及生物材料支架构建生物功能化骨生物材料的理论和技术方法。间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,体内含量最高的是骨髓组织,骨髓间充质干细胞(BMSC)是目前研究最多的干细胞之一,因其具有良好的多向分化能力,获取较为简便等优点,是目前干细胞研究中的热点。BMSC作为种子细胞,目前研究已广泛开展至心脏、肝脏、骨、软骨等组织细胞和器官损伤中。相关研究表明,不同来源的干细胞由于自身差异可能表现出对于同一种材料的不同反应,而不同来源的干细胞在成骨方面也有不同的效果。既往认为“支架”、“种子细胞”、“活性因子”是骨组织修复材料不可或缺的三要素,但是随着生物材料研究的不断深入,使得关于细胞因子的研究逐渐丰富,种子细胞的重要性逐渐弱化,细胞因子在生物材料研究中占据越来越重要的角色。不同的复合活性因子的材料在研究中有着不同程度的促进成骨、成血管的优势,无需额外添加细胞的复合因子-支架材料则为生物材料的研究提供了新的思路。其中较为常用的细胞因子包括骨形态发生蛋白(BMP)及血小板衍生生长因子(PDGF),BMP-2是转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族一类的多功能生长因子,其具有促进成骨及促进成骨细胞分化的功能,并表达特异性的成骨细胞产物。而PDGF-BB是人体内重要的促有丝分裂因子之一,能促进成骨细胞的生长,骨折局部由于机械损伤产生大量PDGF,促使骨原细胞转化为成骨细胞,从而促进骨折的愈合。不同的细胞因子对骨生物材料的成骨成血管效果的影响尚存在争议。因此,加强骨生物材料的基础研究,构建载细胞活性因子的新型生物功能化骨生物材料,观察其在体内骨组织修复中的作用效果,同时了解其在体内的降解速度、骨传导及骨诱导性能,不仅对提高骨生物材料的认识具有相当的科学意义,也可为临床骨缺损的治疗提供全新的治疗思路和技术方法。研究目的本研究所使用的骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,分离后进行体外培养扩增,与β-TCP材料支架共培养并成骨诱导分化,观察材料对SD大鼠BMSCs增殖及成骨分化的影响。此外,β-TCP搭载BMP-2/PDGF-BB构建组织工程骨修复SD大鼠颅骨标准骨缺损,观察β-磷酸三钙复合材料在骨组织再生修复应用的效果,为骨生物材料的基础研究,成骨及成血管提供实验资料和科学依据。研究方法1.SD大鼠骨髓间充质干细胞在β-磷酸三钙复合材料中的增殖及成骨分化材料使用新型β-TCP复合物(CaPfromGEM21),材料预制成直径3.6mm,厚度1.5mm的圆盘形支架,采取双侧股骨、胫骨骨髓,用密度梯度离心法分离并扩增BMSCs,第三代BMSCs做流式细胞学检测表面标记物,后将第三代BMSCs与β-TCP支架于24孔培养板共培养,每个β-TCP支架种植细胞数3*105个,添加成骨诱导培养液(含100nM地塞米松,10mMβ-磷酸甘油,0.05mM抗坏血酸和10nnM维生素D3)对BMSCs进行成骨诱导分化21天,对照组采用同样方法将BMSCs 种植于材料,使用普通培养液培养。第1、4、7、14、21天根据实验计划需要进行电镜扫描,Live/Dead染色法对细胞生长活性进行检测,观察成骨组及对照组BMSCs增殖。pNpp定量法对碱性磷酸酶(ALP)活性进行检测,通过实时逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定其骨钙素(OC)I型骨胶原(Co1-I),碱性磷酸酶(ALP)及RunX-2成骨基因的表达结果。茜素红染色法对在材料支架进行染色并定量成骨过程形成的矿化物,观察BMSCs在材料支架上的成骨诱导分化。2.载骨形态发生蛋白-2/血小板衍生生长因子-BB的β.磷酸三钙复合材料用于修复SD大鼠颅骨标准骨缺损的实验研究材料使用复合了骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein,BMP-2)或血小板衍生生长因子-BB(Platelet Derived Growth Factor-BB,PDGF-BB)的β-磷酸三钙材料Calcium Phosphate from Growth-factor Enhanced Matrix 21 (CaPfromGEM21),每组材料搭载BMP-2/PDGF-BB中的一种,BMP-2(浓度为10mg/100ng)/PDGF-BB(浓度为0.3ug/3ug),另设置单纯材料组、空白组各1组,共6组实验组：(1)CaPfromGEM21；(2)CaPfromGEM21+10ng BMP-2; (3)CaPfromGEM21+100ng BMP-2；(4)CaPfromGEM21+0.3ug PDGF-BB; (5)CaPfromGEM21+3ug PDGF-BB；(6)空白组。实验动物为健康的SPF级3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠,3%戊巴比妥钠腹腔灌注麻醉动物,用环钻于顶骨两侧制作两个直径为3.6mm的全层圆形骨缺损,两侧缺损随机植入两组不同的实验材料,术后6周处死动物并取出标本进行检测,标本检测方法包括：X线、Micro CT,苏木素-伊红染色(HE染色)及相关的定量分析。研究结果体外扩增可见大鼠间充质干细胞生长旺盛,呈长梭形、旋涡状或麦浪状细胞集落成,流式细胞学检测提示采集的细胞符合骨髓间充质干细胞表面标记特点。大体观察可见间充质干细胞在支架上生长增殖活跃,电镜扫描图片可以观察到BMSCs在β-TCP支架表面贴附生长,细胞伸展形态自然,表现出良好的生长活力。Live/Dead染色提示细胞在支架上增殖活跃,活细胞百分数定量结果提示对照组与成骨组之间在1/4/7/14天各时间点的活细胞百分比之间均无统计学差异；视野活细胞数定量结果提示随培养时间延长,组内活细胞数逐渐增加,成骨组第7/14天每视野活细胞数均明显大于第1/4天,两组间比较,同一时间点间均无统计学差异。ALP活性测定提示成骨组ALP活性逐步升高,而对照组则没有明显升高趋势。成骨组第14/21天结果显著大于其他时间点结果,具有统计学意义。qRT-PCR结果提示成骨组各成骨基因在不同时间点达到峰值,成骨组ALP基因表达第四天达峰值,约为第1天5倍。COL-Ⅰ及OC基因表达峰值均出现在第7天,均为第1天表达量6倍,而RunX-2基因峰值出现在第14天,为第1天表达量约3倍。对照组各时间点成骨基因表达量则无明显峰值出现。茜素红染色可见随培养时间延长,材料表面的矿物染色逐渐加深,定量分析提示成骨组第21天矿化定量显著高于成骨组第14天及第7天,两组间同一时间点均有统计学差异。动物手术过程无动物出现麻醉死亡,术后无动物出现感染。X线影像提示各组骨缺损均有不同程度的修复,骨折线逐渐模糊,PDGF-BB组的骨缺损基本修复。Micro CT可见各组骨缺损均有不同程度新生骨长入,新生骨体积定量结果提示添加PDGF-BB组新生骨体积明显高于BMP-2实验组,具有统计学意义(P<0.05)。HE染色切片各组均未见急慢性炎症细胞浸润,缺损中可见染色均一的新生骨组织,新生骨内及周围可见散在的新生血管及其中的红细胞,新生骨面积百分数提示lOng BMP-2组及0.3ug PDGF-BB组新生骨量百分数均明显大于单纯材料组(P<0.05),新生血管密度定量提示4个添加因子的实验组的新生血管密度均明显大于空白组及单纯材料组(P<0.05),4个添加因子的实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论新型p-磷酸三钙复合物材料细胞毒性小,生物相容性好,骨髓间充质干细胞可在其表面成活生长,并保持良好旺盛的增殖及理想的成骨诱导效果。复合BMP-2/PDGF-BB后材料保持良好的生物相容性,骨缺损修复效果优于单纯材料植入,有望成为理想的新型骨再生修复替代材料之一。