【摘 要】
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利用荧光成像技术对细胞膜进行长时间、高特异性的实时跟踪,对研究和细胞膜相关的生物过程具有重要意义。商用化的聚集诱导猝灭（Aggregation-Caused Quenching,ACQ）荧光分子探针和新兴的聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission,AIE）分子探针都是根据传统的细胞膜模型（磷脂双层结构和插在其中的糖蛋白）设计的,大多是以两亲的磷脂分子为靶向单元,通过增
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利用荧光成像技术对细胞膜进行长时间、高特异性的实时跟踪,对研究和细胞膜相关的生物过程具有重要意义。商用化的聚集诱导猝灭（Aggregation-Caused Quenching,ACQ）荧光分子探针和新兴的聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission,AIE）分子探针都是根据传统的细胞膜模型（磷脂双层结构和插在其中的糖蛋白）设计的,大多是以两亲的磷脂分子为靶向单元,通过增强探针分子和磷脂分子之间的静电相互作用和脂质相互作用来提高探针对细胞膜的靶向能力。尽管这两种策略可以在一定程度上提高探针在细胞膜上的保留能力,但所设计的探针还是很容易穿透细胞膜,并对细胞内的其他区域进行染色,导致成像时间短、特异性不强。如Di D和FM家族的染料分子,会在10～15分钟内将细胞的大部分区域或整个细胞染色。最新的细胞膜模型除了含有磷脂双层,还有大量刚性的甾醇分子（动物细胞为胆固醇,植物细胞为谷甾醇）,这使得细胞膜具有一定程度的刚性。本论文提出了一种基于最新的细胞膜模型的抗渗透分子荧光探针的设计策略。该策略从细胞膜的刚性结构出发,设计合成了带有大位阻基团的分子荧光探针,利用探针分子和细胞膜之间的空间位阻效应和聚集诱导发光分子探针的限制诱导发光（Restriction-Induced Emission,RIE）性质,实现了对人体肝癌细胞和植物细胞两种细胞质膜的高特异性靶向和长达1.5小时的高清成像。主要研究内容如下:（1）本文基于最新的具有一定刚性的细胞质膜模型,提出了一种简单而通用的利用探针分子和刚性细胞膜之间的空间位阻效应达到抗渗透效果的分子荧光探针设计策略。本文选用三苯胺基为骨架,引入1,4-二叠氮双环[2.2.2]辛烷作为大位阻基团,并增加不同长度（6C和12C）的烷基链,合成了TPD、TPD-C6和TPD-C12这三种红色发光的聚集诱导发光探针。这些探针具有限制诱导发光的性质,在受限的环境（如插入单层胶束）中能发出明亮的光,因此适用于细胞膜成像。本文用所设计的探针分子对人体肝癌细胞（Hep G2）进行染色,并采用分子骨架相同但没有大位阻基团的探针分子TVP进行对照。实验表明TVP分子在0.5小时之后就会穿透细胞膜,而TPD、TPD-C6和TPD-C12这三种探针在1.5小时后仍保留在细胞膜上,证明了大位阻基团的存在可以有效阻止探针分子渗透进细胞内。其中,TPD-C12的成像效果最好,这是因为12C的烷基链可以通过脂质-脂质相互作用将探针分子结合在膜上。（2）植物细胞膜外面存在结构复杂的细胞壁,细胞壁上存在着小孔。细胞壁和细胞膜之间的距离非常接近,探针在对细胞膜进行成像之前必须要先穿透细胞壁的小孔,这使得设计植物细胞膜荧光探针具有很大的挑战性。到目前为止,几乎没有关于聚集诱导发光探针同时成像动植物细胞膜的报道。为了验证抗渗透策略的有效性和普适性,本文将所设计的抗渗透聚集诱导发光探针用于拟南芥幼苗根尖细胞的质膜成像。结果表明,TPD和TPD-C6能够穿透细胞壁的小孔,对植物细胞质膜进行成像,且成像完整度高、轮廓清晰,持续时间长达1.5小时。而烷基链较长的TPD-C12则很容易在细胞壁外面发生聚集,无法对细胞膜进行成像。证明了所设计的探针要穿透细胞壁的小孔,必须要具备合适的分子大小,这为植物细胞质膜探针的设计提供了一个非常有价值的原则。本文还利用洋葱内表皮细胞的质壁分离实验证明了探针对细胞膜的特异性。总之,本文设计的抗渗透聚集诱导发光探针对人体细胞和植物细胞都能进行长时间（大于1.5小时）的成像,不会对细胞内的其他区域进行染色,在成像完整性、特异性方面都表现出优异的性能。这表明本文提出的抗渗透策略具有有效性和普适性。此外,这些探针还具有超快染色、免洗、生物相容性好、光稳定性好、受黏度和p H变化影响较小等优点。
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