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成功地用于多肽药物的聚合物缓释微球技术至今未能成功地应用于蛋白药物,主要是蛋白分子的高级结构在制剂过程中脆弱易变、失活甚至导致有害的免疫反应。实现蛋白药物缓释技术的突破有赖于通过改善微球制备条件避免蛋白变性及有害抗体的产生。本研究旨在以促红细胞生成素(EPO)这样一个具有代表性的蛋白药物为例探讨缓释微球制备条件对蛋白免疫原性的影响,建立起两者之间的相关关系。EPO是目前所有重组蛋白药物中全球销售额最大、也最容易在缓释剂型制备中发生聚集并产生严重免疫原性的产品,其含有165个氨基酸、30400Da的分子量,主要用于治疗肾病、癌症、化疗以及HIV感染引起的贫血。由于EPO治疗的大多是慢性疫病,用药周期长,目前一周三次的频繁注射造成了很大的用药顺应性问题。缓释注射剂型可望成为解决这一问题的理想方案。但是缓释剂型制备过程造成的EPO聚集和抗原化同样可能产生由EPO的注射剂引起的强烈的免疫反应—纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA),使EPO由治疗贫血的药物变成引发贫血的元凶。鉴于微球剂型制备过程中的水-油界面和水-气界面是公认的造成蛋白聚集的原因,本人所在的研究室开发了诸如低温冷冻相分离、亲水“油”相中乳化(S-O-hO)等一系列避免水-油和水-气界面的微球制备新方法,使蛋白在温和条件下与多糖形成可以耐受有机溶剂的玻璃体颗粒,并在无水条件下乳化成为PLGA微球。为了验证这些新方法能否如预期的那样避免蛋白的聚集和免疫原性,本研究运用SEC-HPLC、ELISA和促UT-7细胞生长及其抑制法,采用BALB/C小鼠模型,考察EPO在每一微球制备阶段的聚集度、抗体的产生和生物活性的变化。实验结果证明采用上述无水-油和水-气界面的新方法制备的EPO-葡聚糖微粒大小均匀(粒径1～5μm)、表面光滑、EPO的生物活性保留率较好(90%左右)。达到这一步骤的EPO没有发生聚集。上述含有EPO的葡聚糖微粒通过亲水“油相”为连续相的无水乳化法(S/O/hO)包封于PLGA微球并且与常规的“油包水-水包油”法(W/O/W)及“油包固体-油包油”法(S/O/O)进行了比较。三种方法制备微球的包封率皆为75%左右。就EPO的聚集而言,随SEC-HPLC进样浓度的变化,从W/O/W法和S/O/O法制备的微球中回收的EPO发生了不可逆聚集。而从S/O/hO法微球中回收的EPO发生了可逆聚集。关于免疫原性,注射了W/O/W和S/O/O法微球的小鼠体内的抗EPO抗体量明显多于注射了S/O/hO法微球的小鼠。细胞抑制实验发现注射了W/O/W法微球的小鼠的血清比注射了其它两种方法的微球的小鼠血清更多地抑制UT-7细胞的增殖。SEC-HPLC、ELISA和UT-7细胞实验较一致地证明S/O/hO法制备的EPO微球较其它方法在防止EPO的聚集和免疫原性、保持蛋白活性上有一定的优势。同时三个方法的一致性也互相证明这三个方法的协同使用可以作为评价EPO微球剂型安全性的手段。