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肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,H.hepaticus）是一种可诱发啮齿类动物多种疾病的病原菌。该菌广泛存在于实验动物群体,严重影响实验动物的质量,干扰试验结果,在一些发达国家早已将该菌列为啮齿类动物必须排除的病原微生物,而我国实验动物行业未引起足够的重视。并且,近年来,从恶性肝胆疾病患者的体内也检测到了肝螺杆菌的特异性DNA片段,提示着人类肝胆疾病可能与肝螺杆菌感染有关。目前关于肝螺杆菌检测,最常用的方法为定量PCR,而免疫学检测方法匮乏,主要原因是国内外的特异性和灵敏性H.hepaticus单克隆抗体较少。因此,研制出灵敏度高、特异性好的单克隆抗体对H.hepaticus检测及相关疾病的诊断具有重要的公共卫生学意义。1.肝螺杆菌CdtB单克隆抗体的制备及鉴定细胞致死性肿胀毒素（Cytolethal distending toxin,CDT）存在于多种革兰氏阴性菌,该毒素是由CdtA、CdtB和CdtC组成。已有研究表明,CdtB作为肝螺杆菌主要的毒力因子,能够导致宿主细胞周期的阻滞和细胞最终的死亡,与肝螺杆菌的致病性有关。本试验选取CdtB抗原性较好的区域（17aa-273aa）,将其克隆至原核表达载体,成功构建出pET-6×His-NUSA-TEV-CdtB重组质粒,并转化到宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导发现6×His-NUSA-TEV-CdtB蛋白主要以可溶形式表达。将表达的重组蛋白经Ni-NTA层析柱纯化后,使用TEV蛋白酶切除助溶标签6×His-NUSA,得到的产物再次经过Ni-NTA层析柱的纯化,最终获得纯度较高的可溶性CdtB蛋白。将CdtB蛋白按照免疫程序及单克隆抗体制备流程,最终获得1株能稳定分泌CdtB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,编号为2D9。经抗体亚型鉴定,2D9单克隆抗体为IgG2a亚类,小鼠腹水单抗效价达到1:51200,Western blot反应性良好,IFA鉴定特异性较好。利用真核表达载体pcDNA3.1-RFP表达截短的CdtB蛋白,通过Western blot和IFA试验初步鉴定CdtB蛋白单克隆抗体2D9识别构象抗原表位。该单抗的成功制备,既为CdtB蛋白功能的研究提供了生物材料,又为肝螺杆菌的检测和防治提供重要的生物试剂。2.肝螺杆菌MCP单克隆抗体的制备及鉴定甲基受体趋化蛋白（Methyl-accepting chemotaxisprotein,MCP）作为细菌运动趋化相关的受体蛋白,在细菌粘附、侵袭、定植宿主细胞中起着关键的作用。本试验对肝螺杆菌MCP（HH1088）蛋白进行截短,选取抗原性较好的区域（1aa-318aa）进行克隆表达,构建出pCold-MCP重组表达质粒并转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导发现MCP蛋白主要以可溶形式表达。将重组蛋白经过Ni-NTA层析柱纯化得到的MCP蛋白免疫小鼠,按照免疫程序以及单克隆抗体制备流程,最终获得2株稳定分泌肝螺杆菌MCP蛋白单克隆抗体的细胞株,编号分别为5A7和2A1。经亚型鉴定,2株单克隆抗体均为IgG2b亚类,腹水效价达到1:12800以上,Western blot反应较好。利用真核表达载体pcDNA3.1-RFP表达截短的MCP蛋白,通过IFA试验初步鉴定MCP蛋白单克隆抗体 5A7 和 2A1 分别识别 202DQTNLLALNAAIE214 和 213IEAARAGEHGRG224 线性抗原表位。该单克隆抗体的研制,为MCP蛋白的功能研究、趋化相关信号通路的研究以及肝螺杆菌的检测方法的建立提供生物学材料。3.肝螺杆菌CdtB和MCP单克隆抗体的初步应用本试验以前两章制备的肝螺杆菌CdtB和MCP单克隆抗体为基础,分别建立IHC试验,结果证明制备的CdtB和MCP抗体均可适用于IHC试验,且效果较好。本试验以第二章纯化的融合蛋白6×His-MCP为抗原,根据腹水效价,挑选出单抗5A7,经过公司使用HRP标记后作为酶标竞争抗体,建立了检测肝螺杆菌的竞争ELISA检测方法。经过蛋白包被浓度、酶标抗体稀释度、血清稀释度、竞争作用时间、最适封闭液的优化,最终确立了灵敏度高、特异性好、重复性好的竞争ELISA检测方法。利用该方法对扬州附近多个动物设施随机采集的50只小鼠的血清进行检测,阳性率70%,同时使用PCR检测50只小鼠粪便,阳性率为80%,发现血清检测阳性率比PCR检测稍低,可能是某些肝螺杆菌感染的小鼠没有引起体液免疫应答而导致的。本试验以同样的方法对肝螺杆菌CdtB 2D9 mAb建立竞争ELISA检测方法,但是检测时发现该抗体阴阳界限不明显,不适用于竞争ELISA检测。综上所述,本试验共成功制备了 1株能稳定分泌肝螺杆菌CdtB蛋白的单克隆抗体和2株能稳定分泌MCP蛋白的单克隆抗体,且均具有较好的免疫反应性,为CdtB和MCP相关基础的研究和肝螺杆菌的检测提供了重要的试剂。本试验制备的3株单抗均适用于IHC试验,且基于肝螺杆菌MCP 5A7 mAb建立的竞争ELISA检测技术具有较好的应用前景。