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目的:结直肠癌80%以上由腺瘤癌变而来,结直肠腺瘤的75%～80%为管状腺瘤,临床上结直肠癌由散发性管状腺瘤癌变而来的病例并不少见,但其癌变机制尚不明确。近年来,表观遗传学与肿瘤发生发展的关系成为医学界的热点之一,其中DNA甲基化与结直肠癌的关系也受到了学者们的广泛关注。RUNX3是新近发现的一种抑癌基因,是哺乳动物RUNX家族成员,是该家族进化的基础[1]。研究发现,RUNX3蛋白是转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的重要因子之一,可指导TGF-β/smad复合物从细胞浆转入细胞核内特定靶位点,加强Smad复合物与靶位点的结合强度并激活靶基因,从而参与细胞增殖、分化与凋亡等生物学行为[2],同时RUNX3与人类多种肿瘤的发生、发展有着密切关系,在许多肿瘤中表达下调,其下调机制主要为甲基化[3]。Wnt通路在结直肠癌发生发展过程中起重要作用,β-catenin是其重要成员。β-catenin作为一种多功能蛋白,具有细胞粘附和信号传导功能[4],一是与E-钙黏蛋白连接形成E-Cadherin-β-catenin功能复合体,介导细胞的粘附;二是作为信号分子参与Wnt信号转导通路,参与胚胎发育及肿瘤发生[5]。正常细胞胞浆中游离的β-catenin水平较低,但当APC、β-catenin或axin发生基因突变时可导致β-catenin胞浆积聚并异位到细胞核内与转录因子结合诱导靶基因表达,参与肿瘤的发生[6]。Ito等[7]研究发现RUNX3能与β-catenin/TCF4（T细胞因子4,TCF4）形成三元络合物,减弱β-catenin/TCF4复合物与DNA结合的亲和力,下调β-catenin/TCF4复合物下游靶基因表达,从而减弱Wnt信号转导通路的活性。结直肠管状腺瘤上皮异型增生和癌变往往呈局灶性分布,激光捕获显微切割（laser capture microdissection,LCM）方法能快速、准确切割和分离异型增生和癌变细胞,有效克服细胞异质性造成的偏差。目前有关采用LCM技术进行结直肠管状腺瘤异型增生和癌变的研究以及探讨RUNX3和β-catenin在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中的意义及相关性研究尚未见报导。为进一步探讨散发性结直肠管状腺瘤癌变机制,以激光捕获显微切割技术结合病理形态学观察、免疫组织化学、Western blot、RT-PCR及甲基化特异性PCR的研究方法,分析正常大肠粘膜、伴有不同程度异型增生的散发性结直肠管状腺瘤和腺瘤癌变中RUNX3和β-catenin的表达情况,同时探讨两者的相关性以期揭示二者在散发性结直肠管状腺瘤癌变中的可能作用,为结直肠腺瘤癌变的防治奠定理论基础。方法:1免疫组织化学方法采用免疫组织化学ElivisionTMplus两步法,检测了23例正常大肠粘膜、81例散发性结直肠管状腺瘤伴异型增生病例和20例腺瘤癌变病例中RUNX3及β-catenin蛋白的表达情况。2蛋白免疫印迹（Western blot）用Western blot方法检测了17对新鲜结直肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜内RUNX3及β-catenin的表达情况。匀浆法提取组织总蛋白,经15%SDS-PAGE电泳,电转移于PVDF膜上,5%脱脂奶封闭1.5小时。一抗（RUNX3 1:200;β-catenin 1:400）4oC过夜,二抗（1:8000）37oC孵育1.5h,ECL显色。Snygene全自动凝胶成像分析系统分析蛋白的表达,以RUNX3、β-catenin与内参照GAPDH的比值分别表示其相对表达量。3 RT-PCR应用RT-PCR检测了17对新鲜结直肠腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜内RUNX3mRNA的表达。采用Trizol液氮研磨法提取组织总RNA,1%琼脂糖电泳鉴定其完整性,并经紫外分光光度计进行定量和纯度检测。取500ng总RNA经逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR反应。结果采用凝胶分析软件（BIO-LD）进行定量分析,以RUNX3与内参照基因β-actin的比值来表示其相对表达量。4甲基化特异性PCR（MSP）4.1激光捕获显微切割（LCM）17对新鲜结直肠腺瘤癌变组织和相应正常大肠粘膜组织及41例石蜡管状腺瘤伴不同程度异型增生组织行10μm切片,贴于LCM专用薄膜载片（Leica公司）上。应用Leica 6000 LMD系统行显微切割,所得组织进行DNA甲基化研究。4.2甲基化特异性PCR（MSP）依照Qiagen公司MicroDNA提取试剂盒说明书抽提显微切割所得组织DNA,将DNA进行焦亚硫酸钠及氢醌处理,处理后的DNA于-20℃冰箱备用。设计RUNX3基因的甲基化引物和非甲基化引物并进行PCR检测。Snygene全自动凝胶成像分析系统观察分析RUNX3甲基化情况。5统计学分析应用SPSS13.0软件,采用χ2检验,两相关样本非参数检验（wilcoxon符号秩和检验）及spearman相关分析法。P<0.05时认为差异有统计学意义。结果:1 RUNX3在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况1.1 RUNX3蛋白的表达情况1.1.1免疫组织化学结果在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴上皮异型增生及腺瘤癌变组中RUNX3阳性表达率分别为91.30%（21/23）、54.32%（44/81）和15.00%（3/20）。腺瘤伴上皮异型增生和腺瘤癌变组中RUNX3的阳性表达率明显低于正常大肠粘膜组,有统计学意义（P<0.05）。管状腺瘤癌变组RUNX3阳性表达率明显低于管状腺瘤伴异型增生组,有统计学意义（P<0.05）。管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中RUNX3的阳性表达率分别为75.76%（25/33）（I级）、60.87%（14/23）（II级）和20.00%（5/25）（III级）,重度异型增生组RUNX3阳性表达率明显低于轻、中度异型增生组,差异有统计学意义（P<0.05）;中度异型增生组RUNX3阳性表达率低于轻度异型增生组,但无统计学意义（P>0.05）。1.1.2蛋白免疫印迹（Western blot）结果RUNX3蛋白分子量为4546KD,以GAPDH（34KD）为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量。统计分析表明,散发性结直肠管状腺瘤癌变组织内RUNX3蛋白表达显著低于相应正常大肠粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）。1.2 RUNX3 mRNA在散发性结直肠管状腺瘤癌变组织与相应正常大肠粘膜中的表达17对结直肠管状腺瘤癌变组织及相应正常大肠粘膜中均可见RUNX3 mRNA表达。统计分析表明,管状腺瘤癌变组织RUNX3 mRNA表达量显著低于相应正常粘膜组织,有统计学意义（P<0.05）。1.3 RUNX3在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中甲基化情况1.3.1激光捕获显微切割结果17对结直肠管状腺瘤癌变组织的癌巢与相应正常大肠粘膜以及41例石蜡腺瘤组织的腺体被完整的从间质细胞中分离出来,切割后的目的细胞完全从切片上落入eppendorf管管帽上,无杂合细胞成分。1.3.2 RUNX3 DNA甲基化的检测结果甲基化特异性PCR（MSP）结果:RUNX3在正常大肠粘膜、管状腺瘤伴异型增生组织及管状腺瘤癌变组织中甲基化率分别为5.89%（1/17）、17.07%（7/41）和41.18%（7/17）。腺瘤癌变组织中RUNX3基因甲基化阳性率明显高于正常粘膜组及腺瘤伴异型增生组,差异有统计学意义（P<0.05）。管状腺瘤伴上皮异型增生组中RUNX3甲基化率高于正常粘膜组,但无统计学意义（P>0.05）。结直肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组织的RUNX3甲基化率分别为13.33%（2/15）（I级）、16.67%（2/12）（II级）、21.43%（3/14）（III级）,甲基化率随异型程度增高而升高,但无统计学意义（P>0.05）。1.4 RUNX3甲基化与RUNX3蛋白及mRNA表达的相关性分析在17例管状腺瘤癌变病例中,RUNX3发生甲基化病例的RUNX3蛋白及mRNA表达明显低于未发生甲基化的病例,差异有显著性（P<0.05）。2β-catenin在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况2.1免疫组织化学结果正常大肠粘膜、管状腺瘤伴上皮异型增生及管状腺瘤癌变组织中β-catenin蛋白阳性表达率分别为13.04%（5/23）、60.49%（49/81）和90.00%（18/20）。管状腺瘤伴上皮异型增生和管状腺瘤癌变组中β-catenin阳性表达率明显高于正常大肠粘膜组,有统计学意义（P<0.05）。管状腺瘤癌变组中β-catenin阳性表达率明显高于管状腺瘤组,差异有统计学意义（P<0.05）。在管状腺瘤伴轻、中、重度异型增生组中β-catenin阳性表达率分别为39.40%（13/33）（I级）、65.21%（15/23）（II级）、84.00%（21/25）（III级）,重度异型增生组β-catenin阳性表达率显著高于轻度异型增生组,有统计学意义（P<0.05）。重度异型增生组β-catenin阳性表达率高于中度异型增生组,中度异型增生组高于轻度异型增生组,但均无统计学差异（P>0.05）。2.2蛋白免疫印迹（Western blot）结果β-catenin蛋白分子量约为92KD,以GAPDH（34KD）为内参照,经图像分析系统对杂交条带进行定量。统计分析表明,管状腺瘤癌变组织内β-catenin蛋白表达显著高于相应正常大肠粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）。3 RUNX3、β-catenin在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中的相关性相关分析显示,在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中RUNX3和β-catenin无明显相关性（P>0.05）。结论:1在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中,RUNX3蛋白及mRNA的表达逐渐降低。2在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中,RUNX3甲基化率逐渐增高,且发生甲基化的病例RUNX3 mRNA及蛋白表达均低于未发生甲基化的病例。3在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中,β-catenin蛋白的表达逐渐增高,且由胞膜逐渐向胞浆/胞核异位表达。4在散发性结直肠管状腺瘤癌变过程中,RUNX3和β-catenin之间无明显相关关系。