藏绵羊是中国最古老的绵羊品种之一,主要分布在海拔2500 m以上的青藏高原及其毗邻的高寒牧区,是青藏高原的主要畜种资源,也是当地人民群众的主要生活和生产资料。由于近年来自然和人工因素的影响,藏绵羊的生产性能、抗病及抗逆等高原适应特性呈现一定程度的下降趋势。因此,开展藏绵羊的遗传多样性及其不同地理生态群体所采取的适应性进化机制研究对藏绵羊的保护利用和种质创新以及遗传改良是十分必要的。主要组织相容性复合体(MHC)是脊椎动物中与机体免疫系统具有重要作用的功能基因家族之一,其所编码的MHC分子具有递呈抗原并触发免疫反应以及维持机体世代适应环境变化的能力和功能,也是研究脊椎动物适应性进化研究的最佳遗传标记。本研究以5个藏绵羊生态群体(甘肃3个群体和青海2个群体)为研究对象,克隆测定藏绵羊DQA和DQB座位基因序列并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术检测DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因mRNA在18月龄甘南藏绵羊背最长肌等17个组织中的相对表达量,以及利用PCR-SSCP技术分析DQA1、DQA2、DQB1和DQB2基因遗传特征,以期揭示其与藏绵羊高原适应性进化的机制。主要研究结果及结论如下:1.藏绵羊DQA和DQB座位基因克隆测序及生物信息学分析(1)藏绵羊DQA1和DQA2基因CDS区片段长度为768 bp,编码255个氨基酸,蛋白质分子质量分别为28.23 KD和29.83 KD,理论等电点(PI)分别为5.20和4.76。生物信息学预测发现DQA座位的2个基因蛋白都属分泌蛋白,且都具有较强的亲水性,主要分布在内质网、高尔基体和细胞膜中;在2个基因蛋白中共发现了27个磷酸化位点,但未发现糖基化位点;预测还发现,在DQA蛋白中存在3个结构域和1个跨膜结构域;二级结构是以无规则卷曲和α-螺旋为主的混合型;基于氨基酸序列进行的进化分析,其与牛、山羊、马等物种的同源性较低,与其亲缘关系的远近一致。(2)藏绵羊DQB1和DQB2基因CDS区片段长度为786 bp,编码261个氨基酸,蛋白质分子质量分别为29.91 KD和30.05 KD,理论等电点(PI)分别为5.52和8.83。dqb座位的2个基因蛋白都属分泌蛋白,且都具有较强的亲水性,主要存在于细胞外、细胞膜和内质网中;在2个基因蛋白中共发现了38个磷酸化位点和4个糖基化位点;预测还发现,在dqb蛋白中存在4个结构域和2个跨膜螺旋区域;二级结构是以无规则卷曲和α-螺旋为主的混合型,基于氨基酸序列进行的进化分析,其与牛、山、马等物种的同源性较低,与其亲缘关系的远近一致。2.dqa和dqb座位基因mrna在藏绵羊不同组织中的表达量藏绵羊dqa和dqb座位的4个基因在其背最长肌、大脑、肺和肝等17个组织中均有表达,但表达水平具有组织特异性。其中,dqa1基因在背最长肌、脾脏、肾上腺、肾脏、甲状腺和卵巢组织中的呈现高度表达,在肺、心脏、瓣胃、网胃和瘤胃组织中中等表达;dqa2基因在脾脏、心脏和卵巢中的表达量最高,在肝、后腿肌肉、回肠和瘤胃组织中有中等量的表达;dqb1基因在肝、回肠和卵巢组织中的表达量较多,在肾上腺和心脏组织中的表达量中等;dqb2基因在瓣胃、甲状腺、脾脏、小脑和胰腺组织中的表达较多,在后腿肌肉组织中的表达量中等。3.基于dqa和dqb座位基因的藏绵羊适应性进化研究(1)藏绵羊dqa和dqb座位基因遗传特征①藏绵羊5个群体的ola-dqa1基因第2外显子中共存在16个等位基因,分别命名为dqa1*a、*b、……*o和*p。序列比对发现,它们和已有绵羊dqa1基因序列具有很高的同源性,共存在54个核苷酸多态位点,占分析序列位点总数的20.07%;在氨基酸序列中共有26个(32.50%)氨基酸发生变异。②藏绵羊5个群体的ola-dqa2基因第2外显子的序列分析后发现了17个等位基因,分别命名为dqa2*a、*b、……*p和*q,其中,等位基因dqa2*i-*q在藏绵羊上首次发现,dqa2*a-*h是已公布的ola-dqa2基因第2外显子的已有序列;它们和已有绵羊dqa2基因序列具有很高的同源性。在序列分析中共发现71个核苷酸多态位点,约占分析位点总数的29.34%。在氨基酸序列中共有41个(56.90%)氨基酸发生突变。③藏绵羊5个群体的ola-dqb1基因第2外显子上确定了5个等位基因,分别指定为dqb1*a-*e。序列比对后发现,它们和已有绵羊dqb1基因序列具有很高的同源性。在序列分析中共有61个核苷酸多态位点,约占分析位点总数的21.79%,在氨基酸序列中共有36个(40.45%)氨基酸发生突变。④藏绵羊5个群体OLA-DQB2基因第2外显子的序列分析后确定了21个等位基因,分别命名为DQB2*A、*B、……*T和*U。它们和已有绵羊OLA-DQB2基因座序列具有很高的同源性。在序列分析中共有48个核苷酸多态位点,约占分析位点总数的18.68%;在氨基酸序列中共有31个(38.75%)氨基酸发生突变。(2)藏绵羊DQA和DQB座位基因选择作用平衡选择是维持藏绵羊OLA-DQA和DQB座位基因多态性的主要机制之一。OLA-DQA1、DQA2、DQB1和DQB2 4个基因的抗原结合位点(ABS)的非同义突变率均高于同义突变率,揭示藏绵羊DQA和DQB座位的4个基因均受到了平衡选择的作用。(3)藏绵羊DQA和DQB座位基因重组基因重组是藏绵羊DQA座位基因的主要进化模式之一,但在DQB座位基因中未发现重组事件。在DQA1等位基因序列中,检测到2个重组事件,均由Max Chi方法检测到;而在DQA2基因检测到4个重组事件,有2个事件是由Max Chi和SiScan两种方法检测到。(4)藏绵羊DQA和DQB座位基因的群体结构和种群分化基于DQA和DQB座位基因的分化系数表明,甘南甘加型藏绵羊与其他4个群体的分化显著。根据AMOVA分析结果,将5个藏绵羊群体依据地理位置划分为2个区域,即甘肃甘南群体(OLX、QKX和GJX)和青海群体(QHOLX和QHGYX),表明甘肃甘南和青海5个藏绵羊生态群体区域之间的变化大于同一区域不同群体间的变化,结果支持了此区域的划分。