研究背景汗孔角化病(Porokeratosis,PK)是一组罕见的、具有遗传异质性的角质形成细胞克隆异常性皮肤病。该病遗传模式主要表现为单基因常染色体显性遗传性,其病因尚不完全明确,遗传因素、机体免疫抑制、日光暴露等多项因素均可参与疾病的发生。各亚型PK共同的组织病理学特点:皮肤中央沟内的角化不全柱。根据临床特征如皮损的数量、大小、形态等以及组织病理学特点对PK进行分类。临床上可分为多个临床亚型,其中经典分型包括至少6个临床亚型:经典型Mibelli型(PM)、浅表播散型汗孔角化症(DSP),播散浅表性光化性汗孔角化症(DSAP)、线状汗孔角化症(LP),掌跖合并播散性汗孔角化症(PPPD),点状汗孔角化症(PP)。除此之外,尚有10余种较少见临床亚型被报道,既往研究发现PK患者除了临床特点的异质性外,遗传学也存在异质性。截止目前共发现至少7个连锁区域基因位点(12q23.2-24.1,15q25.1-26.1,18p11.3,1p31.3-p31.1,16q24.1-24.3,12q24.1-24.2)及 7 个致病基因(SSH1、SART3、SLC17A9及甲羟戊酸代谢通路相关4个基因(MVK,PMVK,MVD,FDPS)与PK发病密切相关。PK基因型和表型存在一定相关性。但既往研究尚存在以下问题1.既往文献报道已经发现的致病基因只能解释部分PK病例发病原因:1)MVK可解释29%(25/87)PK家系患者及20%(13/65)散发患者;2)2015年zhang等报道MVK,PMVK,MVD,FDPS基因以来,上述4个基因可以解释96%家系PK患者及67%散发PK患者。2.甲羟戊酸代谢通路上其他基因与PK相关性有待进一步研究:自2012年MVK被报道与PK发病相关以来,已发现该通路上4个基因与PK发病相关。该通路共有12个相关基因,是否都与PK发病相关有待进一步研究。3.PK遗传异质性强,致病基因较多,Sanger测序方法检测存在多种弊端。4.SSH1,SART3,SLC1 7A9既往报道与PK相关,但存在质疑:2004年自SSH1、SART3被报道与PK相关以来,多个团队对该基因进行检查,但未发现致病突变。国外学者认为SSH1可能并不是DSAP致病基因,截止2015年国内认为只有MVK是DSAP的致病基因。SSH1,SART3,SLC1 7A9与PK的关联性有待于进一步研究。针对上述背景开展本项研究,通过本项研究以期解决以下问题:1.总结上述患者临床特征,研究发现其致病变异,并总结基因型和表型之间关系;2.验证甲羟戊酸代谢通路上其他基因是否与PK发病相关;3.进一步验证SSH1,SART3,SLC1 7A9基因与PK之间的关联性。第一部分140例汗孔角化症患者临床特点分析1.研究目的:通过对PK患者的发病特点、临床表现、临床亚型等进行回顾性分析,全面认识PK。同时通过临床特点总结,以期发现其与基因型之间相关性。2.研究方法:总结2003年-2017年我院收集的140例(64个家系及76个散发PK患者)PK患者临床资料,调取其临床登记信息如性别、年龄、发病年龄、临床亚型等信息,对上述信息进行汇总分析。3.研究结果:140例先证者中,男性87例,女性53例,男女比例为1.64:1。发病年龄从出生至76岁,平均发病年龄31.2岁。患者的发病年龄主要集中在40岁之前,40岁之后发病人群逐渐减少。140例先证者分为以下7个亚型:112例DSAP/DSP患者,9例PM,7例大斑块型(PPt),4例线性(LP),5例角化过度型(HPM)及3例生殖器受累患者(Genital PK)(其中1例合并DSP)。DSAP/DSP发病年龄跨度最大,从出生-76岁;PM型多于出生时即发病;PPt发病年龄较晚,平均发病年龄31岁;局限于生殖器部位的2例患者均于50岁以后发病。4.研究结论:从上述临床特征分析,PK患者男性患病高于女性,男女发病比例约为1.64:1;发病年龄跨度较大,从出生至60岁以上均可发病,但主要发病期位于出生起至40岁之间,青春期发病率较高。PK临床亚型以DSAP\DSP患者最多,约为总患者数量的80%。且不同的临床亚型与发病年龄之间存在一定关联性。第二部分采用高通量目标区域测序对140例汗孔角化症进行遗传学分析1.研究目的:1)发现与PK相关的致病基因或新的致病变异;2)验证甲羟戊酸代谢通路上12个基因是否均参与了 PK的发生3)验证既往报道的3个基因(SSH1,SART3,SLC1 7A9)是否为PK的致病基因;4)通过本项研究结果发现的基因型与表型之间对比,发现基因型与表型之间关联性。2.研究对象:选取自2003年-2017年本院收集的PK患者共140例(64个家系及76个散发PK患者),无亲缘关系、且不患该病的正常对照380例外周血DNA进行遗传学研究。3.研究方法:采用高通量目标区域测序,借助48.48 Access ArrayTMMicroflui dics Fluidigm平台和Illumina MiSeq system平台对以下15个基因包括既往报导的3个基因(SSH1,SART3,SLC17A9)及甲羟戊酸途径上的12个基因(ACA T1,ACAT2,HMGCR,HMGCS1,HMGCS2,MVK,PMVK,MVD,FPDS,IDI1,IDI2,GGPS1)进行测序及数据分析。对阳性测序结果采用Sanger Sequencing进行验证。4.研究结果:通过NGS我们发现了 125个罕见变异(113 SNVs和12 frameshift variants)。这些变异位点位于上述研究基因的外显子区域和剪切位点区域。通过功能预测,我们在121个患者中发现了 66个功能变异(54 SNVs and 12 frameshift)。这 些 SNVs 分 布 在 以 下 11 个 基 因 上(ACAT1,ACA T2,HMGCR,MVK,PMVK,MVD,FPDS,IDI1,SART3,SLC17A9,SSH1)。其中有8个先证者在2个或者3个基因上携带多个SNVs。经Sanger测序验证发现:66个SNVs中46个为阳性突变位点。该46个突变位点分布111个汗孔角化症先证者中。其中包括29个错义突变,9个框移突变,4 个剪切位点突变及 3 个 stop-gained mutations(5.0%)。20 non-pathogenic SNVs通过验证被排除。家系中正常对照及380例健康对照未发现上述突变位点。上述46个突变位点分别位于7个不同的致病基因中,其中MVK通路上5个致病基因(MVK,PMVK,MVD,FDPS,HMGCR)以及SSH1和SLC1 7A9基因。26个先证者携带21个MVK突变,其中11个为新发突变。64个先证者携带11个MVD突变,其中3个为新发突变,突变位点c.746T>C和c.875A>G在50个先证者中被发现,可解释78%的MVD突变,为热点突变。9个先证者携带3个PMVK突变,其中2个为新发突变,突变位点c.100G>A和c.412C>T分别在4个先证者中被发现,解释89%PMVK突变,考虑为热点突变。此外,S50携带2个突变位点PMVKc.100G>A和MVD c.746T>C,F28 也携带 2 个突变位点PMVK c.100G>A 和 c.604G>A。另外,我们发现了 7个FDPS突变,其中6个为新发突变。有趣的是我们首次发现了一个HMGCR:c.539G>A。另外,在SSH1基因上发现2个新发致病突变位点:S76,临床亚型为DSAP,携带错义突变c.177T>A。F64,临床亚型为DPS,携带错义突变c.382C>T。另外,S3与S35携带相同突变位点,SLC1 7A9:c.C25T。总之,140例PK患者中共在111(79%)个患者中发现46个突变位点。(21%)例患者未发现致病突变。通过分析基因型与表型之间关联性分析发现存在以下关联:1.发病年龄与基因型相关性:平均发病年龄31.2岁。MVD突变的患者,发病年龄跨度较大,自出生至76岁,平均发病年龄36.74岁,MVK突变患者一般发病年龄为青春期,平均发病年龄27.94岁;FDPS患者平均发病年龄最大,48.14岁;2.MVD突变患者最多,59(42.1%)个PK患者携带MVD突变,其中c.746T>C和c.875A>G为热点突变位点,但MKV不同突变数最多;3.巨大斑块型PK只与MVK基因突变相关,与elife报道一致。该现象在30%的存在MVK变异的PK患者中发现(6/20),与既往报道不同(50%);4.一例DPS合并genital PK的患者发现FDPS,c.200T>C(p.Met67Thr)突变,与既往报道genital PK仅与PMVK相关不同;5.LP发生与PMVK和MVD基因突变相关;6.携带FDPS突变的患者皮损数量最多,且皮损直径较小;7.SLC1 7A9基因突变只与DSAP相关。5.结论:通过对140例PK患者进行遗传学分析,我们共在111(79%)个先证者中发现46个致病突变位点,25个为新发突变位点,29(21%)PK患者未发现致病突变。上述46个突变位点分别位于7个不同的致病基因中,其中甲羟戊酸代谢通路上5个致病基因(MVK,PMVK,MVD,FDPS,HMGCR)及SSH1和SLC17A9基因。我们首次发现HMGCR基因突变与PK发病相关。迄今在甲羟戊酸代谢通路共发现5个基因与PK发病相关,提示该通路上的其他基因均有可能参与PK的发生。2004年以来本研究再次在PK患者中发现2个SSH1新发基因突变位点,进一步表明该基因与PK发病机制可能相关。此外,我们发现一既往报道SLC1 7A9基因突变,证实该基因参与PK的发生。但本研究未发现SART3基因突变。以上研究结果均表明存在遗传异质性。除此之外,通过分析发现基因型与表型之间存在7种特殊关联性。第三部分SSH1基因缺陷患者SSH1基因表达分析1.研究目的:研究发现SHH1突变与PK发生密切相关,但该结论在既往多项研究中未得到证实,该基因致病性存在争议,有学者推测SSH1可能不是PK的致病基因。但本研究在1例DSAP家系及1例散发病例中发现2个新的SSH1基因突变,经功能预测均为有害突变。本研究通过免疫组化检查含SSH1基因突变患者皮损SSH1蛋白表达情况,进一步明确SSH1与PK发生是否存在关联性。2.研究方法:选取一例本研究中发现的含有SSH1基因突变的典型DSAP病例的皮损组织(lesional tissues,LTs)及皮损旁组织(neighboring normal-appearing skin,NNS),以及1健康对照(healthy control)皮肤组织进行免疫组化试验。抗体分别选取抗角蛋白1(keratin 1),角蛋白14(keratin 14),内皮蛋白(involucrin)和抗SSH1抗体。keratin 1为角质形成细胞的分化marker,主要集中在棘层,Keratin 14标记不成熟的角质形成细胞,Involucrin为内参抗体,在棘层合成,主要集中在颗粒层。SSH1可在皮肤组织中表达,主要集中在基底层。3.研究结果:研究发现在皮损及皮损旁组织中,抗keratin 1(角化细胞在棘层的分化标志)抗体在角状板层及颗粒层中未能检测到;抗Keratin 14(标记角化细胞未成熟)抗体在角状板层中可以检测到,表明角质形成细胞在PK患者中未完全分化;内皮蛋白在角状板层及颗粒层中缺失。SSH1主要位于表皮的基底层。抗SSH1抗体在角状板层及颗粒层中也未能检测到。4.结论:通过免疫组化分析,我们发现与健康对照相比,SSH1主要位于LTs和NNS的基底层,而不是整个表皮。我们推测损伤性突变可能影响SSH1的表达,其在DSAP患者中,破坏皮肤表皮细胞形态结构的形成。通过本研究进一步提示SSH1可能参与了 PK的发病机制。