基于秀丽隐杆线虫模型研究卵转铁蛋白对机体的影响及作用机制初探

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卵转铁蛋白(ovotransferrin,OVT)含量居鸡蛋清蛋白质第二位,具有铁结合和释放能力,亦具有丰富的营养价值和多种生理活性,如抗菌、抗氧化和免疫调节等。但OVT进入机体后的作用机制尚不完善,还有待进一步的研究和明确。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans,以下简称线虫)作为一种模式生物,具有清晰的遗传背景、肠细胞和营养代谢相关同源信号通路与人类相似,不受伦理学约束等优点。为了探究OVT对机体生理功能的影响,本研究采用线虫作为模式生物,通过构建线虫在不同生理状态下的模型,探讨OVT对线虫的影响,并采用转录组学与代谢组学技术对其中的作用机制进行初步解析和研究,旨在为OVT作为活性因子在保健食品中的应用和禽蛋的深度开发利用提供理论依据。主要方法、内容、结果与结论如下。(1)通过体视显微镜观察OVT对健康状态线虫生长发育、运动能力和寿命的影响,并采用正置荧光显微镜观察其脂褐素积累水平,采用特异性荧光探针和酶活性检测试剂盒测定对其氧化应激系统的影响;通过百草枯(PQ)和叔丁基过氧化氢(t BHP)两种诱导剂诱导线虫发生急性氧化应激,研究OVT对其抗逆性的影响。结果表明:与对照组相比,线虫的体长和运动能力均得到改善和提升,体长平均提高6.38%,30 s内头部摇摆频率和身体弯曲频率分别增加9.99%和39.09%,平均寿命显著延长8.2%;经对线虫体内相关抗氧化酶活性的检测,线虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性以及谷胱甘肽(GSH)水平均得到提高,其中SOD活性增加50%,CAT活性增加5%,POD活性增加25%,GSH水平增加10%;线虫体内因氧化而形成的代谢产物:内源性活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)以及脂褐素的水平都呈下降趋势,其中ROS下降10.19%,MDA下降14.5%,脂褐素积累水平降低5.61%;经113 m M PQ或2 m M t BHP处理的线虫,摄入OVT后,其存活率均得到提高,其中PQ组的增加48.56%,t BHP组的增加15.96%。OVT能够提升健康状态线虫的体长和运动能力,增强其机体抗氧化应激能力,并延长其寿命。(2)采用铜绿假单胞杆菌PAO1对线虫进行感染,研究被致病菌感染时OVT对其产生的影响。结果表明,线虫被PAO1感染24 h后没有发生死亡,但其生长发育出现迟缓,与喂食大肠杆菌OP50的对照组相比,线虫的体长和运动能力均下降,其中体长显著减少3.39%,30 s内头部摇摆和身体弯曲频率分别下降1.75%和27.67%;体内GSH的水平增加2.41%;体内因PAO1及其代谢产物在肠道中积累引起的氧化应激形成的代谢产物,包括初期产物O2·-和ROS以及脂褐素的水平均有不同程度的显著增加,其中O2·-增加29.71%,ROS增加6.23%,脂褐素增加22.31%;其肠道屏障功能亦遭到破坏,肠道屏障渗透性显著增加20.45%。摄入OVT 48 h后的被感染线虫,其生理生化平衡有所回调,生长发育和运动能力能够部分恢复,体长平均提高9.29%,30 s内头部摇摆频率和身体弯曲频率分别增加31.52%和4.40%;体内的氧化应激反应明显减轻,其中GSH的水平显著升高5.91%,O2·-水平下降16.46%,ROS水平下降4.55%,脂褐素积累水平下降14.1%;线虫肠屏障渗透性下降11.41%,但未能恢复至正常水平。OVT能够增强被PAO1感染线虫的抗菌和抗氧化应激能力,促进其修复肠道屏障损伤,从而提高线虫抵抗致病菌感染的能力。(3)借助DNBSEQ基因测序平台,对摄入OVT的线虫进行基因组测序,通过与线虫参考基因组(GCF_000002985.6_WBcel235)的分析和比对,共鉴定出201个显著差异表达基因(DEGs,Fold Change>1.5,Qvalue<0.05),其中有58个基因被上调,143个基因被下调;根据Gene Ontology(GO)数据库分析结果,DEGs在生物学过程(Biological Process)中主要富集到涉及代谢和生长发育相关的过程,而且二者均受能量代谢的影响,包括调节蜕皮周期、调节角质层的发育和胶原蛋白合成、蛋白酶解、有机酸代谢、异源物质分解代谢和氧化还原等过程。机制分析表明:OVT对线虫生长发育的影响机制,主要是通过调控线虫蜕皮功能基因的表达量而实现;OVT主要是通过提高线虫体内酶催化活性的机制,从而使其体内SOD、CAT和POD活性增强,GSH水平增加,氧化产物ROS、MDA以及脂褐素形成量减少;线虫被PQ或t BHP外源化学诱导剂诱导氧化应激后,OVT提高其存活率的作用机制主要是通过提高线虫体内I相和II相生物转化中相关酶的活性从而提高其对外源有毒化合物代谢的能力。通过SJ4143[ges-1::GFP(mit)]突变株对线虫肠道部位能量传递进行评估,证实OVT能够显著提高其肠道线粒体的活动能力。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对显著差异基因集进行分析,主要富集到5条与脂质合成代谢相关的通路,这些通路涉及脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、过氧化物酶体、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路和脂肪酸降解。通过机制的分析表明,OVT对线虫脂质代谢过程的影响机制,主要是通过调控线虫的各类脂肪酶以及脂质合成与分解相关的基因,从而激活上述信号通路。对能量代谢的调控也是OVT影响线虫的主要机制之一。(4)采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF MS)分析技术对线虫摄入OVT后的代谢产物进行分析,共筛选出246种代谢产物,其中有效注释出差异代谢物127种,以脂质和类脂化合物为主,但也有少量的蛋白质和碳水化合物的代谢物。并将这些代谢物分别与KEGG数据库和人类代谢组数据库(HMDB)进行比对,通过对差异代谢产物进行功能注释及富集分析发现,主要涉及的途径是脂质代谢、氨基酸代谢及能量代谢。机制分析结果表明:OVT对线虫的生长发育和寿命的影响机制,部分是通过调控葡萄糖和海藻糖等机体供能物质的含量实现;OVT提高线虫体内抗氧化酶催化活性的机制,部分是通过激活脂质代谢途径从而提高多不饱和脂肪酸的含量实现;OVT增强线虫抗逆性的机制,部分是通过提高电子呼吸链的中间代谢产物含量实现,也还通过调控线虫体内谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸等含量实现;OVT对线虫能量代谢的影响机制,部分是通过提高甘油磷酸胆碱和类二十烷酸的表达量实现;OVT对线虫脂质代谢的作用机制,部分是通过激活PPAR信号通路实现。(5)综合转录组学和代谢组学的分析结果,线虫的cyp-35A5和sod-2等基因上调和甘油磷酸胆碱、二十碳五烯酸(EPA)、红景天苷等代谢物含量增加与OVT提高其抗氧化酶活性和抗逆性有关,是通过部分上游编码细胞色素氧化酶的基因和下游脂质代谢的途径诱导,且其中可能有多不饱和脂肪酸的参与。线虫acox-1.2、acox-1.3和maoc-1等基因上调和组氨酸、谷氨酸等代谢物含量增加可能与OVT促进其生长发育有关,说明OVT通过促进线虫的脂质分解、提高关键氨基酸含量进而提高线粒体的活性来影响ATP的合成和细胞的代谢,最终增强了线虫的能量代谢,从而促进其生长。(6)借助Alpha Fold2数据库,选择红景天苷进行分子模拟对接,以验证OVT对线虫的影响机制。结果显示,红景天苷可以通过氢键和范德华力等非共价作用直接与IIS和MAPK通路中关键的上游调控因子及其下游靶标结合,且产生稳定的构象。因此,OVT对线虫生理水平影响的部分机制可能是通过代谢物-红景天苷来发挥作用,并与其它代谢物共同进一步激活下游的应激诱导基因。但OVT对线虫影响的更精准机制,尚需深入研究。
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