研究背景:良好的血液供应,是维持脑组织正常代谢和生理功能的基础。脑组织细胞发生的缺血性损伤(ischemia injury)常常发生在不同原因形成的脑组织局部缺血之后。缺血组织在恢复血流灌注后,其结构和功能的损害及代谢障碍往往还会进一步加重。这种现象称为缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)。以缺血-再灌注损伤为主要病理改变的缺血性脑卒中具有发病率高(占脑卒中87%),致残率高和致死率高的特点。给人们的健康带来很大威胁。莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)广泛存在于十字花科植物如西兰花、孢子甘蓝、卷心菜中。研究表明,莱菔硫烷在抗肿瘤、抗凋亡、抗氧化以及抗炎抗菌等方面发挥着重要的作用。莱菔硫烷能通过血脑屏障,这使得它具有成为神经保护物质的潜质。近年来,关于莱菔硫烷在各种组织器官缺血-再灌注损伤中的作用研究也时有报道。脑缺血-再灌注损伤的发病机制是一个复杂而迅速的级联反应过程,其主要环节包括细胞内能量代谢障碍、钙超载、NO合成过多、脑组织兴奋性氨基酸的毒性反应、自由基生成、线粒体功能紊乱、炎症反应、凋亡基因激活等。这些机制相互联系,相互影响,形成恶性循环,从而导致缺血区脑组织不可逆的损伤。以往研究得较多的是氧化应激产生的氧自由基对组织的损伤。近年来大量实验证据表明炎性损伤过程在脑缺血-再灌注的发生发展中起着至关重要的作用。脑组织缺血阶段的多种因素诱导炎症因子的活化和募集,这些因素在再灌注阶段又会进一步介导炎症反应的级联放大效应,并最终导致脑缺血区细胞和组织的损伤。多项研究显示,炎症小体的活化对整个炎症反应过程的启动和发展起着非常重要的作用。NLRP3是目前被研究得最多和最明确的nlr蛋白,它可以被多种形态结构和分子序列完全不同的模式分子活化。nlrp3炎症小体不仅可以感应病毒、细菌等病原微生物(pamp)的入侵,而且可以感知多种“危险信号”(damp)。nlrp3能够识别相应配体结构,导致其构象发生改变,募集并绑定pro-caspase-1。pro-caspase-1活化为caspase-1后将pro-il-1β裂解为成熟的il-1β,il-1β作为重要的炎症介质,可以诱导其它炎症介质产生,并促进下一阶段的炎性反应。在脑缺血-再灌注过程中,由炎症小体自身介导的,依赖caspase-1的细胞死亡―“细胞焦亡(pyroptosis)”,也是促进缺血脑组织损伤的重要过程。Janus激酶是一类非受体型胞质内可溶性蛋白激酶,其家族包含4个成员(jak1-3、tky2),其中jak2在脑组织中的表达较其它几种janus激酶更高。stats,即信号转导子和转录激活子,是jaks的直接底物。目前stat家族有7个成员(stat1-4、stat5a、stat5b及stat6),其中stat3广泛存在于中枢神经系统。JAK-STAT信号通路代表的是一条极其快速的从细胞外到细胞核的信号转导途径。在细胞生殖、分化、凋亡、坏死以及应激、炎性反应、免疫调节等多种生理以及病理生理过程中发挥着重要作用。其中jak2-stat3信号转导通路在脑缺血-再灌注损伤过程中起到重要的调节作用。对缺血脑细胞的存活或死亡起着重要影响。Ag490是一种特异性的jak2抑制剂,能抑制jak2的酪氨酸磷酸化,从而抑制jak2-stat3信号通路的激活。目前,关于jak2-stat3信号转导通路在脑缺血-再灌注损伤的炎性反应过程中所起作用的研究已有开展。但实验数据较少且实验结果差异很大。jak2-stat3信号通路的激活究竟是促使损伤加重还是保护神经细胞目前并没有一致的结论。jak2-stat3信号通路在脑缺血-再灌注损伤中的具体作用机制尚不明确。综上,本课题在建立稳定可靠的大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型(mcao)的基础上,观察验证莱菔硫烷对缺血-再灌注后脑组织损伤的保护作用,找到保护效果较好的给药浓度和给药时间;同时通过观察莱菔硫烷作用后nlrp3炎症小体及其下游炎症介质活化和表达情况,找到莱菔硫烷通过抗炎作用实现其神经保护功能的证据;此外,我们还通过对比莱菔硫烷和ag490作用后对jak2-stat3信号通路的激活及其对后续效应的影响,对jak2-stat3信号通路在脑缺血-再灌注炎性反应中的作用及莱菔硫烷与jak2-stat3信号通路的关系进行初步探讨。第一部分:莱菔硫烷对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用目的:建立稳定可靠的大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型(mcao),探讨莱菔硫烷的神经保护作用。方法:1.建立模型:采用改良线栓法复制大鼠局灶性脑缺血(mcao)模型。2.分组:实验动物分为5组,即假手术组(sham),模型组(mcao);mcao+dmso组;mcao+莱菔硫烷(5mg/kg)组;mcao+莱菔硫烷(10mg/kg)组。3.检测指标:神经功能症状评分;脑梗死体积测定;脑组织髓过氧化物酶(mpo)水平检测。结果:1.mcao模型组和mcao+dmso组相较假手术组,神经功能评分明显增高;莱菔硫烷处理组可有效降低缺血-再灌注后大鼠的神经功能评分。2.mcao模型组和mcao+dmso组梗死体积较大,莱菔硫烷处理组可显著缩小缺血-再灌注后大鼠的脑梗死体积。3.mcao模型组和mcao+dmso组相较假手术组,脑组织髓过氧化物酶(mpo)活性明显升高,莱菔硫烷处理组可明显著降低缺血-再灌注后大鼠脑组织中mpo活性。结论:1.通过改良的线栓法建立大鼠局灶性缺血-再灌注(mcao)模型,该模型重复性好,成功率较高,对缺血及再灌注时间控制较好,手术损伤比较小,是一种较为理想的用于研究脑缺血-再灌注损伤的模型。2.莱菔硫烷可改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,减轻缺血-再灌注后的炎症反应过程从而实现对大鼠脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用。第二部分:nlrp3炎症小体在莱菔硫烷神经保护中的作用目的:探讨莱菔硫烷是否通过影响nlrp3炎症小体,影响脑缺血-再灌注过程中的炎症反应来实现其神经保护作用。方法:1.分组:将实验动物分为4组,即假手术组(sham)、模型组(mcao)、mcao+dmso组,mcao+莱菔硫烷(5mg/kg)组。2.检测指标:elisa检测莱菔硫烷处理后缺血脑组织中il-1β,il-18的水平变化;rt-pcr检测莱菔硫烷处理后缺血脑组织中nlrp3mrna水平;westernblot检测脑莱菔硫烷处理后缺血脑组织中nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18的蛋白表达变化。结果:1.mcao和mcao+dmso组相较假手术组(sham),其nlrp3mrna水平和蛋白表达水平均增高;mcao+sfn(5mg/kg)组nlrp3mrna水平和蛋白表达水平较mcao组明显降低。2.mcao组和mcao+dmso组与sham相比,caspase-1、il-1β和il-18的表达均增高,mcao+sfn(5mg/kg)组caspase-1、il-1β和il-18的表达均较mcao组低。结论:1.莱菔硫烷能减少nlrp3的表达,抑制nlrp3炎症小体的激活,使得caspase-1活化减少,继而减少caspase-1介导的炎症因子il-1β和il-18的表达和分泌。2.莱菔硫烷的神经保护作用可能是通过抑制nlrp3炎症小体的激活,减少炎症介质产生,抑制过于激烈的炎症反应过程来实现的。第三部分jak2-stat3信号通路的激活在莱菔硫烷神经保护中的作用目的:探讨jak-stat3信号通路在莱菔硫烷抗炎,抗缺血-再灌注损伤的过程中所起的作用。方法:1.分组:将实验动物分为5组,即假手术组(sham)、模型组(mcao)、mcao+sfn组,mcao+ag490组、mcao+sfn+ag490组。2.检测指标:神经功能症状评分;脑梗死体积测定;脑组织髓过氧化物酶(mpo)水平检测;westernblot检测jak2、p-jak2、stat3、p-stat3、nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18的表达情况。结果:1.mcao组较sham组神经功能评分增高,脑梗死区域明显,mpo活性增加;应用ag490后,即mcao+ag490组,神经功能评分进一步增高,脑梗死区域更加明显,mpo活性进一步增加;mcao+sfn组,相较mcao组神经功能评分降低,脑梗死体积明显减小,mpo活性减弱;mcao+sfn+ag490组与mcao+sfn组相比神经功能评分升高,脑梗死体积增大,mpo活性增强。2.mcao组较sham组p-jak2、p-stat3的水平有升高,nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18表达也增高;应用ag490后,即mcao+ag490组,p-jak2、p-stat3的水平降低,而nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18表达增高。mcao+sfn组相较mcao组p-jak2、p-stat3的水平明显升高,nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18的表达明显降低;mcao+sfn+ag490组与mcao+sfn组相比p-jak2、p-stat3的水平明显降低,nlrp3、caspase-1、il-1β和il-18的表达明显升高。结论:1.莱菔硫烷可改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,减轻脑缺血-再灌注后的炎症反应过程从而实现对大鼠脑缺血-再灌注损伤的神经保护作用;jak2抑制剂ag490能减弱莱菔硫烷的这种神经保护作用。2.莱菔硫烷可激活jak2和stat3,使p-jak2、p-stat3水平明显升高,同时抑制NLRP3炎症小体的激活,降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。莱菔硫烷的这一作用可被JAK2抑制剂AG490逆转。3.在脑缺血-再灌注损伤过程中,莱菔硫烷可能是通过激活JAK2-STAT3信号通路,抑制NLRP3炎症小体的激活,减轻缺血-再灌注过程中的炎症反应来实现其神经保护作用的。