Dectin-1/磷脂酶Cγ信号通路在角膜上皮细胞抗真菌感染固有免疫阶段作用的研究

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目的:研究在人角膜上皮细胞抗烟曲霉菌菌丝抗原感染的固有免疫过程中,Dectin-1受体通过胞内磷脂酶Cγ(Phospholipase Cγ,PLCγ)信号传导通路产生免疫应答的作用机制。方法:常规体外培养的人角膜上皮细胞(HCECs),随机分为空白对照组、真菌刺激组和通路受体阻断组,用烟曲霉菌菌丝抗原感染体外培养的HCECs,建立真菌感染的细胞模型,此为真菌刺激组,通路受体阻断组分别用U73122(PLCγ抑制剂)、Piceatannol(Syk抑制剂)及Laminarin(Dectin-1阻断剂)预处理30min,后加入烟曲霉菌菌丝抗原刺激液。应用Real time-PCR和ELISA技术方法检测不同时间点CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平的表达情况。于5、15、30、45min用Western blot方法检测通路蛋白PLCγ及脾酪氨酸激酶(spleen-tyrosine kinase,Syk)的表达情况。激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+变化。结果:真菌菌丝抗原刺激HCECs后可引起CXCL1和IL-8 mRNA和蛋白水平表达升高,呈时间和浓度依赖性,时间为8h,浓度为5×106/ml时达高峰,差异有统计学意义(p<0.05);抗原刺激后PLCγ磷酸化水平上调,30min达高峰。抑制PLCγ磷酸化能明显下调CXCL1和IL-8的表达(p<0.05);阻断Dectin-1受体下调抗原引起的PLCγ磷酸化水平(p<0.05)。菌丝刺激HCECs可明显增强胞内Ca2+释放,U73122和Laminarin预处理后的胞内Ca2+释放相比菌丝刺激组明显降低(p<0.05)。菌丝刺激引起Syk磷酸化水平上调,阻断Dectin-1受体能下调Syk的活化(p<0.05)。Syk的抑制也可以使PLCγ的磷酸化水平下调(p<0.05)。结论:PLCγ作为Dectin-1的下游分子参与角膜上皮细胞抗真菌感染。烟曲霉菌菌丝抗原刺激人角膜上皮细胞可明显增强胞内Ca2+的释放,Dectin-1/PLCγ信号通路参与固有免疫阶段胞内Ca2+的释放。Syk作为Dectin-1通路中的下游蛋白参与调节PLCγ的活化。
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