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在酸性土壤上铝毒害是影响农作物产量的限制因素之一。通常,解决铝毒害的方法是大量施用石灰来提高土壤的pH值,使游离铝沉淀。但是这种方法难以彻底解决土壤酸度和铝毒害问题,同时还存在着潜在的环境问题。提高酸性土壤上作物的产量有效且可持续的措施是筛选和培育耐铝毒作物品种。因此,研究耐铝毒机理、克隆耐铝毒基因可以为铝敏感植物的遗传改良奠定理论基础。在酸性土壤中,铝对微生物也能产生毒害作用,如抑制生长。微生物生长快,周期短,易操作,是研究耐铝机理较好的模式生物体。研究微生物的铝毒害和耐铝毒机制,可以为植物耐铝毒机制的研究提供一种新视角。钙调素(Calmodulin,CaM)在真核生物中广泛存在,它的主要作用是参与多种生理过程。钙/钙调素信号途径由钙离子、钙调素和钙调素下游的靶蛋白三种组分组成,钙调素只有与靶蛋白相互作用,才能将信号传递下去,进而发挥生物学功能。研究表明钙离子、钙调素及钙调素结合蛋白参与包括干旱,盐胁迫,冷和热刺激等在内的非生物胁迫应答。根据铝胁迫下的SSH cDNA文库结果和CaM基因及CaM结合蛋白基因随着铝处理时间的表达谱数据,我们推测CaM介导的信号途径可能在分子水平参与对铝胁迫的响应。因此本研究主要以土生隐球酵母作为研究材料,分离鉴定CaM结合蛋白,研究CaM及其下游组分在土生隐球酵母耐铝胁迫中的作用及功能,同时分析丹波黑大豆中钙调素及其下游组分在铝胁迫下的的表达情况。本研究取得如下结果：1、钙调素及其下游靶蛋白—钙调磷酸酶(CNA)和钙调蛋白激酶抑制剂对土生隐球酵母生长和耐铝的影响。结果表明,在未加铝的培养基中添加钙调磷酸酶抑制剂(FK-506)、钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),土生隐球酵母的生长没有受到影响,而添加钙调素抑制剂(TFP)的土生隐球酵母生长受到明显的抑制；在含Al培养基中添加FK-506后,土生隐球酵母生长受到明显抑制,而添加KN-93后,土生隐球酵母生长基本没有受影响。2、钙调素及其下游靶蛋白—钙调磷酸酶和钙调蛋白激酶抑制剂对上生隐球酵母耐铝能力的影响。为了进一步验证钙调素及其下游的靶蛋白在土生隐球酵母的生长和耐铝中发挥的作用,分别在不含铝含有抑制剂的固体平板,以及在含有50mM铝和抑制剂的固体平板上观察土生隐球酵母的菌落生长情况,结果表明,与未加铝的CK培养基相比,只有添加TFP的土生隐球酵母菌落变小,生长受到明显的抑制,而添加FK-506和KN-93的菌落没有明显的差别；与含有50mM铝的固体平板上的菌落相比,添加TFP和FK-506的菌落变小,生长受到抑制。而添加KN-93的菌落没有明显的变化。因此,用抑制剂处理的情况下,平板检测的耐铝结果与生长曲线的结果一致。这说明钙调素影响土生隐球酵母的生长,钙调磷酸酶参与铝胁迫下土生隐球酵母的生长,钙调蛋白激酶对土生隐球酵母的生长没有影响。3、利用Western blot分析铝胁迫对土生隐球酵母和丹波黑大豆CaM和CNA蛋白表达水平的影响。结果表明随着铝浓度的增加土生隐球酵母和大豆中的CaM蛋白的表达量逐渐增加,CNA蛋白的表达量呈现先上升后下降的趋势。这与转录水平的变化是一致的。运用GST-Pull down方法验证了铝胁迫下土生隐球酵母和丹波黑大豆CaM和CNA之间的相互作用。这些结果表明在土生隐球酵母和丹波黑大豆中,铝胁迫能够诱导CaM和CNA基因的转录和翻译,而且铝胁迫下CaM和CNA之间是相互作用的。4、利用转基因酵母检测钙调素和钙调磷酸酶基因在耐铝中的作用。平板检测的结果表明随着铝浓度的增加,含pYES3/CT-CNA和pYES3/CT-CaM的两株转基因酵母耐铝程度都明显高于含有空载体pYES3/CT的对照酵母。在含有0.1mM铝的固体平板上,与转基因酵母相比,对照酵母菌落明显变小,表明生长受到抑制。在含有2mM铝的固体平板上,菌液稀释104时,两株转基因酵母都能生长良好,对照酵母基本不生长。通过检测培养基中剩余活性铝的含量,进而检测含pYES3/CT-CNA和pYES3/CT-CaM的转基因酵母吸收或吸附铝的能力。结果表明与转空载体pYES3/CT酵母相比,转pYES3/CT-CaM和pYES3/CT-CNA酵母的培养基中剩余的活性铝含量都明显减少。随着铝浓度的增加,转pYES3/CT-CNA酵母培养基中活性铝含量下降的更明显。这些结果证明CaM及其下游靶蛋白CNA参与了耐铝胁迫反应。