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骨关节炎(OA)是一种慢性关节病,其病理特征为关节软骨变性、破坏及骨质增生等,随着年龄增长患病率明显增加,且女性患病率明显高于男性。在世界范围内,随着人口老龄化进程,到2020年OA将成为第四大致残性疾病,甚至与全因死亡率相关。OA具有遗传性,其发病机制复杂,一般认为,在机械性和生物性因素的相互作用下,关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨合成与降解失衡,从而导致OA的发生。临床治疗OA的主要方法包括非药物治疗、药物治疗和手术治疗等手段,以缓解OA症状、改善关节功能、延缓疾病进程和矫正畸形,这些药物大多能起到缓解疼痛的作用,但无法从根本上延缓OA病程中关节软骨的渐进性退变。以细胞为基础的新型治疗OA的方法受到越来越多的关注。间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和定向分化的潜能,能够修复软骨组织,抑制软骨细胞分泌炎性因子,还可以在体内定向分化成软骨细胞,这为MSCs治疗OA提供理论依据。研究发现,人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)的细胞含量、增殖能力均优于骨髓MSCs,免疫原性比骨髓MSCs低,并且具有取材方便、无伦理学争议等优点,而hUC-MSCs对动物OA模型是否具有治疗作用,如何影响软骨细胞功能及其相关机制尚未清楚。目的:Hulth模型法建立兔和大鼠OA模型,观察hUC-MSCs对动物膝骨关节退变的治疗作用;体外将OA患者软骨细胞与hUC-MSCs共培养,观察hUC-MSCs对软骨细胞功能的影响并探索其相关机制,为临床应用hUC-MSCs治疗OA提供实验依据。方法:1.行膝关节Hulth模型手术对普通级雄性兔进行造模,兔OA模型随机分为模型组、hUC-MSCs(4×10~5,2×10~6,1×10~7cells/ml)组、兔脐带来源的MSC(rUC-MSC,2×10~6 cells/ml)组和注射用玻璃酸钠组(HA,1ml/只,10mg/ml),设假手术动物作为对照组,每组6-8只。所有动物于造模四周后开始关节腔内注射给药,除HA组(每周一次,共5次)外,其它各组仅给药一次,假手术组和模型组关节腔内注射等量细胞溶媒。给药六周后处死动物,测量兔膝关节手术侧与非手术侧关节周径差值;对兔膝关节进行X线正侧位检查,并进行Kellgren–Lawrence评分;手术显微镜观察兔膝关节的股骨髁和胫骨平台,并进行Pelletier评分;HE染色法观察兔膝关节病理变化,并进行Mankin评分。2.行膝关节Hulth模型手术对雄性大鼠进行造模,大鼠OA模型随机分为模型组、hUC-MSCs(0.5×10~6,1×10~6,2×10~6cells/ml)组、hUC-MSCs多次给药组(1×10~6cells/ml)组和HA(50μl/只,10mg/ml),设假手术动物作为对照组,每组6-8只。所有动物于造模四周后开始关节腔内注射给药,除hUC-MSCs多次给药组(每隔一周给药一次,共3次)和HA组(每周一次,共5次)外,其它各组仅给药一次,假手术组和模型组关节腔内注射等量细胞溶媒。给药六周后处死动物,对大鼠膝关节进行X线正侧位检查,并进行Kellgren–Lawrence评分;手术显微镜观察大鼠膝关节的股骨髁和胫骨平台,并进行Pelletier评分;HE染色法观察大鼠膝关节病理变化,并进行Mankin评分;免疫组化法检测大鼠膝关节中Ⅱ型胶原、MMP-13及TIMP-1表达变化;ELISA法检测大鼠关节液中IL-1β、IL-6、MMP-13及TIMP-1的水平。3.体外实验,采用两步酶消化法体外培养OA患者原代软骨细胞,与hUC-MSCs共培养后,收集软骨细胞进行实验。RT-qPCR法检测软骨细胞中多聚蛋白多糖(aggrecan)、col-2及sox-9的mRNA水平;流式细胞术检测软骨细胞凋亡;CCK-8法检测软骨细胞增殖;1,9-二甲基二亚基蓝(DMMB)分光光度法检测软骨细胞中粘多糖(GAGs)含量;免疫荧光法检测软骨细胞中Wnt、β-catenin表达及定位;Western blot法检软骨细胞中Wnt、β-catenin及磷酸化β-catenin表达。结果:1.hUC-MSCs对动物OA模型的治疗作用(1)hUC-MSCs对兔OA模型的治疗作用行膝关节Hulth模型手术法建立兔膝关节炎模型,结果显示,hUC-MSCs(1×10~7cells/ml)给药可显著减轻关节骨质硬化,改善了关节间隙,降低X射线评分;hUC-MSCs(2×10~6,1×10~7cells/ml)可显著降低兔OA模型的膝关节肿胀,改善兔膝关节病理,且显著降低软骨结构、软骨细胞和潮线等评分;各剂量组给药均可明显降低膝关节Pelletier评分,改善软骨损伤。(2)hUC-MSCs对大鼠OA模型的治疗作用大鼠膝关节炎模型结果显示,hUC-MSCs(1×10~6,2×10~6cells/ml)及hUC-MSCs(1×10~6cells/ml)多次给药可显著减轻关节骨质硬化,改善关节间隙,降低X射线评分;降低膝关节Pelletier评分,改善软骨损伤;改善大鼠膝关节病理状态,且显著降低病理评分;hUC-MSCs多次给药对降低病理评分的效果优于同剂量单次给药效果。2.hUC-MSCs对大鼠OA模型中炎性因子水平的影响免疫组化结果显示,模型组中大鼠膝关节Ⅱ型胶原表达显著降低、MMP-13表达增加、MMP-13/TIMP-1比值显著升高,hUC-MSCs(1×10~6,2×10~6 cells/ml)、hUC-MSCs多次给药及HA给药均可明显增加Ⅱ型胶原的表达;显著降低MMP-13的表达以及MMP-13/TIMP-1的比值;hUC-MSCs多次给药对降低MMP-13表达的效果优于同剂量单次给药效果。ELISA结果显示,模型组大鼠关节液中IL-1β、IL-6及MMP-13水平显著升高,各给药组均可显著降低IL-1β、IL-6和MMP-13以及MMP-13/TIMP-1比值。3.hUC-MSCs对OA患者软骨细胞功能的影响IL-1β(10ng/ml)刺激能够显著降低OA患者软骨细胞标志基因aggrecan、col-2及sox-9的mRNA的表达水平,促进软骨细胞凋亡,抑制软骨细胞增殖;加入hUC-MSCs共培养48h,可显著增加aggrecan、col-2及sox-9的mRNA水平,抑制软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖。提示hUC-MSCs可以促进内源性软骨再生。4.hUC-MSCs对OA患者软骨基质降解具有保护作用DMMB法检测OA患者软骨细胞GAGs结果显示,IL-1β(10ng/ml)刺激软骨细胞48h,可使软骨细胞中GAGs含量显著性减少;加入hUC-MSCs共培养48h,可显著性增加软骨细胞中GAGs的含量。提示hUC-MSCs对软骨细胞基质的降解具有保护作用。5.hUC-MSCs可能通过参与Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞功能免疫荧光结果显示,Wnt在软骨细胞胞膜胞浆和胞核中均有表达,β-catenin主要在软骨细胞胞浆中表达。Western blot和免疫荧光结果显示,IL-β(10ng/ml)可显著性降低OA患者软骨细胞Wnt和β-catenin的表达,促进β-catenin磷酸化;hUC-MSCs可以显著提高软骨细胞中Wnt和β-catenin的表达,抑制β-catenin磷酸化,其作用与该信号通路抑制剂GSK-3β抑制剂类似。提示hUC-MSCs可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞功能。结论:1.Hulth模型手术法可成功建立兔和大鼠OA模型,关节腔内注射hUC-MSCs可以改善关节软骨损伤,降低关节病理评分,具有明显的治疗作用,且多次给药在降低大鼠病理评效果优于同剂量单次给药;2.hUC-MSCs关节腔内注射可有效降低大鼠关节腔炎性因子水平,恢复MMPs/TIMPs的平衡,促进Ⅱ型胶原形成,且多次给药在降低MMP-13在大鼠病理关节中表达的结果优于同剂量单次给药;3.体外共培养hUC-MSCs与OA患者软骨细胞,能够抑制软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖,抑制软骨细胞基质的降解;4.hUC-MSCs治疗OA的作用可能与促进软骨细胞标志基因aggrecan、col-2及sox-9mRNA的表达和激活Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞功能有关。