乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤。所有乳腺癌中,大约5%-10%的乳腺癌为遗传性乳腺癌,另外还有20%左右的病例与遗传因素也有关。目前为止已经发现了25个以上的乳腺癌易感基因,包括高外显率的BRCA1(breast cancer susceptibility gene1,乳腺癌易感基因1)、BRCA2(breast cancer susceptibility gene 2,乳腺癌易感基因2)、TP53(Tumor Suppressor Protein 53,肿瘤抑制基因53)、CDH1(cadherin 1,钙黏蛋白1基因)、PTEN(phosphatase and tensin homolog,磷酸酶张力蛋白同源基因)、STK11(serine/threonine kinase 11,丝氨酸/苏氨酸激酶11基因)、NF1(neurofibromin1,神经纤维瘤蛋白1基因)和中度外显率的PALB2(partner and localizer of BRCA2,BRCA2定位和伴侣基因)、CHEK2(checkpoint kinase 2,细胞周期检测点激酶2基因)、ATM(Ataxia Telangiectasia Mutated Gene,共济失调毛细血管扩张症突变基因)、NBN(nibrin Nibrin,蛋白编码基因)等基因。基因测序是评估乳腺癌遗传风险的主要方法。近年来,随着二代测序技术的发展,基因测序已经进入了低成本、大范围、高通量时代,目前已有多个多基因检测平台进入了临床应用。虽然多基因测序技术已经非常成熟,但其临床应用仍然面临很多问题,包括检测对象的选择、检测基因的选择、检测结果的判读特别是VUS的处理等。既往数据表明,世界范围内不同人群的遗传背景差异很大,因此评估中国人群的肿瘤遗传风险就需要相应的中国人群的数据支持。然而目前中国人群的乳腺癌易感基因多基因测序研究数据还非常匮乏。为弥补我国的不足,本研究进行了覆盖全国15个省的28家综合性医院的多中心研究。本研究针对遗传高危乳腺癌患者进行包含40个肿瘤易感基因的多基因测序突变筛查,初步明确我国乳腺癌高危人群的遗传特点和发病规律,从而为临床应用多基因测序评估乳腺癌发病风险奠定基础。在进行多基因测序结果分析的过程中,我们在PALB2基因上发现了许多意义不明的错义突变(VUS)。PALB2基因突变与乳腺癌发病风险密切相关,因此我们针对检测到的VUS设计了一系列细胞功能试验,初步明确了它们的致病性,并对PALB2基因的功能进行了进一步探索。本研究内容共两部分:一、中国遗传高危乳腺癌患者40基因突变筛查;二、PALB2错义突变功能研究。材料与方法:第一部分:从2015年10月到2016年9月,参照“2015年中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范”,根据以下纳入标准,从全国招募遗传高危乳腺癌患者。纳入标准为符合以下任一条的乳腺癌患者:(1)发病年龄≤35岁;(2)有1个或以上近亲(近亲是指一级、二级和三级亲属)为乳腺癌患者或(和)卵巢上皮癌或(和)输卵管癌或(和)原发性腹膜癌患者;(3)单个个体患2个原发性乳腺癌(2个原发性乳腺癌包括双侧乳腺癌或者同侧乳腺的2个或多个明确的不同来源的原发性乳腺癌);(4)男性乳腺癌;(5)合并有卵巢上皮癌或(和)输卵管癌或(和)原发性腹膜癌的既往史;(6)同时满足以上多条(≥2条)者。对纳入的患者进行病历回顾,记录临床信息,然后从外周血采集5ml血样送至北京安诺优达基因公司进行40基因全外显子测序。测序平台为美国Illumina公司的Hi Seq 2500平台。根据美国遗传学会(ACMG)指南将检测出的变异分为有害、可能有害、意义不明、可能良性、良性五类。将有害和可能有害的变异纳入最后的突变结果,分析突变率和突变分布,研究突变和各临床特征的关系。最后单独分析VUS,用生物信息学软件进行有害性预测,针对PALB2的VUS启动下一步功能研究。第二部分:为了验证上一部分检测到的PALB2基因的VUS的有害性,我们首先用慢病毒系统构建PALB2敲减的HEK-293T稳转细胞系,并用RT-PCR和Western Blot检测基因敲减的效率。以pc DNA3.1-Flag-PALB2质粒为模板,用定点突变方法构建突变PALB2的c DNA质粒,测序确认后转入HEK-293T细胞,WB检测PALB2蛋白表达情况。利用p DR-GFP质粒和p CBASce I质粒构建同源重组DNA修复荧光报告系统,转入突变质粒后进行流式分析,检测GFP阳性细胞比例,筛选可能会损害细胞同源重组功能的位点。然后针对筛选出的突变位点,应用免疫共沉淀分别检测携带突变的PALB2蛋白与BRCA1、BRCA2、RAD51以及PALB2自身的结合能力,进一步验证突变位点的有害性并探索其相关机制。主要结果和结论:1.中国遗传高危乳腺癌患者的40基因突变分布1.1根据纳入标准,共招募了937名遗传高危乳腺癌患者,绝大部分为汉族(96.5%)。根据纳入标准,占比最多的为早发乳腺癌(47.6%),其次是家族性乳腺癌(34.7),接下来是双侧乳腺癌(9.2%)等。最终,总共有223名患者携带有害或者可能有害的突变,其中159名携带BRCA1/2基因突变(17.0%)、61名携带非BRCA基因突变(6.5%),另外有3名患者同时携带BRCA1/2基因和非BRCA基因突变(0.3%)。1.2 BRCA1基因的突变率为8.8%(82例),总共53个突变位点,其中50个位点为截短突变,3个为既往研究证明有害的错义突变。检测到的所有突变中,有14(26.4%)为初次发现。BRCA2基因的突变率与BRCA1相当为8.6%(81例),总共67个突变位点,均为截短突变,没有发现已经证实有害的错义突变。BRCA2基因的新发突变比例较高,达到了47.8%。对于非BRCA基因,有15个基因中检测到了有害突变,突变病例数为64(6.8%),其中大多数分布在少数几个既往已经证明与乳腺癌密切相关的基因中,包括TP53(18例)、PALB2(11例)、CHEK2(6例)、ATM(6例)、BARD1(5例)、BRIP1(3例)、CDH1(2例)、RAD50(2例)。非BRCA基因中发现的突变位点有55个,其中截短突变42个、错义突变13个,22个位点为新发位点(40.0%)。另外,我们发现7名患者携带有错义修复(MMR)类基因的突变,还有5名患者携带NQO2(3例)、PPM1D(1例)、ERBB2(1例)这三个与乳腺癌遗传风险关系不明确的基因突变。最后,我们在8名患者身上检测到了MUTYH基因的单等位突变。因为杂合型MUTYH变异的有害性存在争议,所以并未纳入最后结果。1.3 BRCA1/2突变的检出率随着乳腺癌初诊年龄的增加而升高,而非BRCA基因突变的检出率则相反。有乳腺癌或者卵巢癌家族史及个人史的患者,BRCA1/2突变的检出率明显高于无相关病史的患者,而非BRCA基因则无此差别。BRCA1突变和三阴性乳腺癌密切相关而BRCA2突变则和Luminal型乳腺癌联系紧密。P53突变的检出率在Her2阳性乳腺癌(5.2%vs 2.0%,p=0.001)和早发乳腺癌(12/167,7.2%)患者中明显升高。PALB2、CHEK2、BRIP1、MSH2突变似乎和Luminal型乳腺癌有关,但统计学差异不明显。总之,如果作为一个整体来看,所有的临床病理因素都无法对非BRCA基因的突变率进行预测。1.4总共从908名患者身上发现了1352个VUS位点。通过生物信息学软件分析,预测其中64个位点可能有害。针对PALB2基因,总共发现了25个VUS,将在下一部分进行功能验证。2.PALB2错义突变功能研究结果2.1同源重组DNA修复荧光报告结果显示空质粒组几乎无GFP阳性细胞,PALB2野生型组GFP阳性细胞比例为1.36%。点突变中E1018D突变组的GFP阳性细胞比例最低(0.28%),其次是R37H突变(0.89%)和I966T突变(0.92%),均与野生型PALB2有统计学差异(p<0.05),说明这三个突变可以损害细胞的同源重组DNA修复能力,为可能有害的突变位点。2.2针对上一步实验中GFP阳性细胞比例最低的四个点突变(E1018D、R37H、I966T、P240T),应用免疫共沉淀分别检测携带突变的PALB2蛋白与BRCA1、BRCA2、RAD51以及PALB2自身的结合能力。结果显示E1018D突变PALB2蛋白与BRCA2蛋白的结合力较野生型明显降低,R37H突变的PALB2蛋白与RAD51蛋白的结合能力也有降低趋势,但结果并不十分明确。除此以外,携带I966T、P240T两个突变位点的PALB2蛋白结合能力与野生型一致,说明这两个位点可能对蛋白功能没有影响。综上,本研究首次通过多中心的遗传高危乳腺癌患者多基因突变筛查,初步揭示了中国乳腺癌易感人群的易感基因突变分布和各易感基因突变者的临床病理特征,并进一步检测了筛查发现的PALB2基因VUS位点的有害性,发现了E1018D这一有害的错义突变位点和其致病机制。为建立中国人群乳腺癌易感基因突变位点数据库提供了基础数据。明确了多基因测序在乳腺癌发病风险评估方面的临床应用价值。为我国乳腺癌多基因筛查指南的制定及完善提供了首个多中心研究数据。