论文部分内容阅读
不孕不育症是育龄男女未能实现自我意愿生育的生殖系统疾病。来自世界卫生组织的数据显示不孕不育已成为仅次于恶性肿瘤和心脑血管病的全球第三大顽固疾病。据不完全统计，全球范围内不能实现自然生育的育龄夫妇占比约为8%～30%，而且这个比例正在逐年增高。近些年，辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）蓬勃发展，解决了许多不孕不育症患者的生育问题。然而，即便是采用目前世界上最先进的试管婴儿技术，产婴率依然徘徊在25%，远远不能满足生殖障碍患者的需求。不孕症的发病机制错综复杂，其中生殖高龄、卵巢早衰、反复胚胎发育不良及反复胚胎种植失败等被认为是其主要原因。卵巢是最易衰老的器官之一，卵母细胞质量可直接影响受精、胚胎发育、胚胎着床等多个生殖关键环节。卵母细胞质量的下降与本身和其发育过程中周围颗粒细胞的内部结构与形态及功能密切相关，对其内部构造的探查与解析，是了解妊娠失败内在原因的重要基石。本研究主要借助等离子聚焦束扫描电镜（Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope,FIB-SEM）和连续块面扫描电镜（Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy，SBF-SEM）分别对小鼠和人卵丘复合体进行纳米水平大尺度三维重构并以此为基础解析其胞间连接网络和胞内细胞器互作网络，以初步探索卵丘复合体超微结构的重要空间形态特征。
目的:
1.小鼠卵丘复合体三维重构
（1）利用FIB-SEM结合超级计算机以纳米级分辨率三维重构4周龄C57BL/6J小鼠卵丘复合体局部结构。
（2）研究4周龄C57BL/6J小鼠颗粒细胞及其细胞器结构的形态及分布特征。
（3）研究小鼠颗粒细胞胞内线粒体、细胞核、脂滴、线粒体和内质网等细胞器之间的互作现象。
2.人卵丘复合体三维重构
（1）利用SBF-SEM结合超级计算机以纳米级分辨率重构人卵丘复合体及其特征细胞器结构。
（2）描述人卵母细胞周围颗粒细胞的数量、大小、分类等；研究人颗粒细胞亚细胞结构的形态及分布特征。
（3）计算有无表面微绒毛的卵母细胞面积和体积。
（4）探索人卵母细胞胞内线粒体总量以及描述线粒体-内质网复合体（花状结构）的特征等。
方法：
1.选取4周龄雌性健康C57BL/6J小鼠，经腹腔内依次注射孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,HCG)分别诱导卵泡发育和排卵后从输卵管膨大部或卵巢中分离出卵丘复合体，并经固定、染色、包埋后进行FIB-SEM成像。
2.人的卵丘复合体经固定、染色、包埋后进行SBF-SEM成像。
3.使用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件阈值分割法进行卵丘复合体各区域渲染划分。
4.运用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件标记分析进行卵丘复合体各区域分类分析。
5.应用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件腐蚀、膨大进行各细胞器互作位点处理分析。
结果：
1.小鼠卵丘复合体三维重构
（1）成功实现小鼠卵丘复合体局部结构三维重构。
（2）完成小鼠颗粒细胞及各种亚细胞器结构的分离重构。发现小鼠颗粒细胞细胞膜表面有膜泡和纤毛结构；具有典型的类固醇生成细胞细胞器特征，如线粒体、内质网和脂滴等。颗粒细胞线粒体主要聚集于细胞核附近，部分游离在细胞膜附近；内质网与线粒体紧密接触，形成线粒体-内质网偶联结构；线粒体紧密围绕于脂滴附近组成内质网的特殊部分，即线粒体相关联膜（Mitochondria Associated Membranes,MAM）结构，构成脂质合成的中心。且小鼠颗粒细胞内线粒体与内质网距离越近，其连接位点越多。
（3）发现线粒体与细胞核，脂滴、线粒体和内质网等细胞器间存在互作现象。
2.人卵丘复合体三维重构
（1）成功实现人卵丘复合体整体结构三维重构。
（2）成功实现人颗粒细胞整体三维重构。根据颗粒细胞形状进行成功分类并统计各类颗粒细胞数目。
（3）成功实现人卵母细胞及极体大尺度三维重构，且标记分析数据显示出人卵母细胞面积、体积分别为52288.4μm2，1.05989×106μm3。
（4）标记分析显示人卵母细胞体内线粒体总数约为263833个，且人卵母细胞内存在线粒体-内质网复合体花状结构。
结论:
以上结果表明，FIB-SEM/SBF-SEM用于小鼠和人卵丘复合体超微结构探究是可行的，该技术成功实现了小鼠和人卵丘复合体纳米水平大尺度三维重构。这些新发现的特征表明小鼠和人颗粒细胞和卵母细胞间都存在跨带突起结构（Transzonal projections，TZPs)。与颗粒细胞和卵母细胞功能相适应的细胞器结构（如线粒体、内质网等）普遍存在互作现象。
目的:
1.小鼠卵丘复合体三维重构
（1）利用FIB-SEM结合超级计算机以纳米级分辨率三维重构4周龄C57BL/6J小鼠卵丘复合体局部结构。
（2）研究4周龄C57BL/6J小鼠颗粒细胞及其细胞器结构的形态及分布特征。
（3）研究小鼠颗粒细胞胞内线粒体、细胞核、脂滴、线粒体和内质网等细胞器之间的互作现象。
2.人卵丘复合体三维重构
（1）利用SBF-SEM结合超级计算机以纳米级分辨率重构人卵丘复合体及其特征细胞器结构。
（2）描述人卵母细胞周围颗粒细胞的数量、大小、分类等；研究人颗粒细胞亚细胞结构的形态及分布特征。
（3）计算有无表面微绒毛的卵母细胞面积和体积。
（4）探索人卵母细胞胞内线粒体总量以及描述线粒体-内质网复合体（花状结构）的特征等。
方法：
1.选取4周龄雌性健康C57BL/6J小鼠，经腹腔内依次注射孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,HCG)分别诱导卵泡发育和排卵后从输卵管膨大部或卵巢中分离出卵丘复合体，并经固定、染色、包埋后进行FIB-SEM成像。
2.人的卵丘复合体经固定、染色、包埋后进行SBF-SEM成像。
3.使用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件阈值分割法进行卵丘复合体各区域渲染划分。
4.运用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件标记分析进行卵丘复合体各区域分类分析。
5.应用赛默飞公司Amira6.5图像处理软件腐蚀、膨大进行各细胞器互作位点处理分析。
结果：
1.小鼠卵丘复合体三维重构
（1）成功实现小鼠卵丘复合体局部结构三维重构。
（2）完成小鼠颗粒细胞及各种亚细胞器结构的分离重构。发现小鼠颗粒细胞细胞膜表面有膜泡和纤毛结构；具有典型的类固醇生成细胞细胞器特征，如线粒体、内质网和脂滴等。颗粒细胞线粒体主要聚集于细胞核附近，部分游离在细胞膜附近；内质网与线粒体紧密接触，形成线粒体-内质网偶联结构；线粒体紧密围绕于脂滴附近组成内质网的特殊部分，即线粒体相关联膜（Mitochondria Associated Membranes,MAM）结构，构成脂质合成的中心。且小鼠颗粒细胞内线粒体与内质网距离越近，其连接位点越多。
（3）发现线粒体与细胞核，脂滴、线粒体和内质网等细胞器间存在互作现象。
2.人卵丘复合体三维重构
（1）成功实现人卵丘复合体整体结构三维重构。
（2）成功实现人颗粒细胞整体三维重构。根据颗粒细胞形状进行成功分类并统计各类颗粒细胞数目。
（3）成功实现人卵母细胞及极体大尺度三维重构，且标记分析数据显示出人卵母细胞面积、体积分别为52288.4μm2，1.05989×106μm3。
（4）标记分析显示人卵母细胞体内线粒体总数约为263833个，且人卵母细胞内存在线粒体-内质网复合体花状结构。
结论:
以上结果表明，FIB-SEM/SBF-SEM用于小鼠和人卵丘复合体超微结构探究是可行的，该技术成功实现了小鼠和人卵丘复合体纳米水平大尺度三维重构。这些新发现的特征表明小鼠和人颗粒细胞和卵母细胞间都存在跨带突起结构（Transzonal projections，TZPs)。与颗粒细胞和卵母细胞功能相适应的细胞器结构（如线粒体、内质网等）普遍存在互作现象。