金黄色葡萄球菌（Staphylococcua sureus，S.aureus，SA）是自然界常在菌，属条件致病菌，也是造成无特定病原体动物（specific pathogen free animals，SPF）污染的主要微生物之一。对于实验大、小鼠，特别是当机体免疫力下降或处于应激状态时（如运输、进行动物实验时），常因感染SA而影响实验动物质量及干扰动物实验，甚至因动物死亡而造成严重损失。 国家标准（GB14926-2001）规定，SA是SPF实验大、小鼠必须检测并排除的微生物。常规检测需要培养、染色、生化反应、凝固酶试验等多个步骤，要数天才能出结果，而且工作量较大。为了能满足SPF动物SA快速、高通量检测的迫切要求，特进行本课题的研究。 本研究结合微生物学、病理学等方法，利用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和核酸探针技术检测鼠SA，通过试验的特异性、敏感性测定及临床样本的检测、验证，在国内首次建立了快速、精确检测鼠SA基因的方法，为SPF级实验动物微生物质量控制提供一种新的有效工具。 本研究首先采用微生物学、病理学等手段，从疑似SA病的患鼠中分离鉴定出1株SA（SAm0109）。用分离菌株SAm0109和标准菌株SA1800分别接种小鼠，建立了SA感染的动物模型，从临床症状、大体病理变化、细菌学检查和组织病理学四个方面进行研究，探讨了SA的致病机理。SAm0109对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为10^-5.1/0.2ml；SA1800对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.1/0.2ml。感染鼠发生脑液化，肝、脾、肾、肠、肌肉等处可见大小不一的脓肿。在病理组织切片中，肝、脾、肾等组织中均可见炎性细胞浸润。 根据SA耐热核酸酶（thermostable nuclease or thermonuclease，TNase）nuc基因序列设计引物，利用PCR技术扩增nuc基因片段，对SA和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、大肠埃希菌（Escherichia coli）等其他非SA菌株抽提DNA进行扩增。SA的PCR产物出现特异性{)NA扩增片段，而其他非SA均未出现扩增片段，该PCR体系能检出3PgSA一ON八，从提取DNA到PCR扩增及电泳结束仅需4h。用PCR对240份临床样品进行一’检测，检出率为2.9%刀厂240)，与细菌学检查结果的符合率为99.6%。 以3AmO109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其。u。基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM一T中，对重组质粒pGEM一Nuc进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定，序列测定结果正实，所获基因片段的DNA序列与已发表的SA相应基因区域具有很高的同泥i性说明nu。基因在SA不同菌株之间是高度保守的，同时也说明所用的DNA聚合酶续有很高的保真性。 将。GEM一NUC中SA二Ic基因特异性片段酶切回收，标一记后作为核酸斑点杂交试验深针对细菌菌株及临床样品进行了检测。核酸探针与SA一DNA呈杂交阳性，而石其他非SA一DNA呈杂交阴性，斑点杂交检测灵敏度为1 pg基因组DNA。用斑点怜交试验和PCR对322份临床样品进行了检测，检出率为3.1%（10/322），符合率勺100%，与细菌学培养的结果相一致。 以卜:试验结果表明，本研究建立的PCR方法具有高度的敏感性，所制备的核酸探针具有较强的特异性，两者结合后使用，能充分发挥其快速、敏感、特异、高通量喻测的优点，适合于SPF动物SA的监测。 该凌术还可推广应用于临床诊断、环境监测、食品卫生监督、进出口检验检疫等许多领域。通过以方法可使SA的感染早发现、早诊断、早预防，有效控制该病的流于，减少其对人类健康和科学研究所带来的损失，具有较大的社会效益和经济效益。