干细胞是指一类具有分化为各类型细胞能力的多潜能细胞,间充质干细胞可以分化为肌肉、血管、神经前体细胞,表皮干细胞能够分化为神经元、平滑肌细胞或脂肪细胞；脂肪干细胞能够成骨、成软骨和形成肌肉组织,说明这类型干细胞具有从一种组织定向分化为另一种组织细胞的能力。神经干细胞长期以来被定义为：来源于神经系统、能够分化为神经组织；具有自我更新并通过不对称分裂产生子代干细胞的能力。上世纪80年代,有学者成功分离、培养出了小鼠的胚胎干细胞,并在体外将胚胎干细胞诱导分化为神经元、少突胶质和星形胶质细胞,由于胚胎干细胞的来源与伦理学上的限制,促使越来越多其他组织来源的间充质干细胞被发现。骨髓、脂肪组织来源的间充质干细胞在特定诱导剂与微环境的的作用下具有分化为神经元样细胞、施旺细胞、神经胶质细胞的能力。2001年本课题组分离、鉴定出滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells, SMSCs)是一种具有多向分化能力的间充质干细胞,能够在条件培养基的作用下向特定组织分化,研究发现SMSCs能够向骨、软骨、脂肪组织分化。颞下颌关节紊乱病(Temporomandibular disorders, TMD)是指精神因素,社会心理因素,外伤,微小创伤,牙合因素,免疫等多因素导致颞下颌关节及周围咀嚼肌群生理功能、结构与器质性的改变。据统计在人群中的发病率达20%-40%,其临床表现主要为颞下颌关节弹响,关节疼痛,关节杂音,而下颌运动障碍与疼痛,往往是患者就医的主要原因。有学者报道,TMD中疼痛分为三种类型：1.颞下颌关节双板区的滑膜水肿、充血,刺激该区的感觉神经末梢形成疼痛。2.外伤性的骨髓腔外露形成的疼痛。3.不明原因的疼痛。对于前两种疼痛类型可概括为炎性疼痛,是由于感觉神经纤维被关节滑液中的神经肽与促炎性细胞因子等物质刺激而产生的疼痛,第三种不明原因的疼痛多是由于患者的精神与心理因素导致。国内、外研究发现,白细胞介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、(?)中瘤坏死因子-a (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)是导致TMD疼痛最主要的炎性因子。在颞下颌关节炎症性疼痛过程中,P物质(substance P, SP)与降钙激素相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是由颞下颌关节双板区滑膜神经末梢分泌的两种主要的疼痛递质与TMD疼痛发生机制密切相关。在大鼠颞下颌关节炎性动物模型的实验中,研究人员发现颞下颌关节盘周围神经末梢组织的长度与密度相比于对照组有明显的增加,关节盘双板区神经末梢的神经发生,促进了该区域神经纤维标记蛋白PGP9.5与疼痛物质CGRP的表达升高,而神经生长因子NGF受体抑制剂K252A能够降低由NGF导致的疼痛,说明颞下颌关节盘周围神经发生参与了颞下颌关节疼痛的改变。在TMD临床治疗中,高分子量透明质酸(High molecular weight-Hyaluronic acid, Hmw-HA)被广泛应用。HA是构成关节滑液的主要成分,对颞下颌关节的生理功能起着至关重要的作用。目前,临床上使用1%高分子量的透明质酸进行颞下颌关节紊乱病患者的关节腔内注射治疗,旨在通过补充外源性HA,恢复滑液的润滑功能,促进软骨的修复,改善关节功能,缓解患者的疼痛。因此,在本研究中,探讨高分子量的HA能否抑制神经化的SMSCs导致的神经肽的分泌,将为临床上使用高分子量HA治疗TMD关节疼痛提供理论依据。本研究从人颞下颌关节滑膜组织中,分离、纯化、培养出SMSCs,首次应用bFGF定向诱导SMSCs向神经细胞转化；观察神经化的SMSCs与正常SMSCs在神经肽SP、CGRP的作用下炎性因子IL-1β,IL-6与TNF-α的表达,探讨神经肽SP、CGRP与颞下颌关节炎性因子之间的关系,以及高分子量的HA对疼痛物质的抑制作用,为进一步了解TMD滑膜炎导致的疼痛发生、发展过程提供实验依据。本研究分为以下两部分：第一部分人颞下领关节滑膜间充质干细胞神经化的实验研究目的：通过分离培养人颞下颌关节(Temporomandibular Joints, TMJ)滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells, SMSCs)并诱导其向神经细胞分化,研究滑膜间充质干细胞神经化的潜能。方法：实验中采用组织块法分离、纯化培养人滑膜间充质干细胞,采用一定浓度胎牛血清(fetal calf serum, FCS)与条件培养基进行体外培养扩增,使用25ng/ml的碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导SMSCs向神经细胞分化。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；扫描电镜观察分化后的神经样细胞的形态；采用免疫细胞化学、RT-PCR与流式细胞术检测SMSCs在诱导前后对特异性神经干细胞与早期神经元表面标记物Nestin、NF-L的表达。结果：倒置显微镜下可见SMSCs呈现成纤维细胞的形态,bFGF诱导7天后的SMSCs胞体部存在典型的神经细胞样突触伸出,部分细胞呈现多个长轴突样的突触,细胞之间呈现出网状的连接。免疫细胞化学、RT-PCR与流式细胞仪检测发现大部分细胞表达特异性神经干细胞Nestin与早期神经元表面标记物NF-L结论：通过bFGF能够在体外诱导人滑膜间充质干细胞向神经细胞分化。使用bFGF诱导人的滑膜间充质干细胞不仅在形态学上有神经样细胞的改变,而且能够在蛋白、基因水平表达神经干细胞与早期神经元的特异性标记物。第二部分人颞下颌关节滑膜间充质干细胞神经化与疼痛的相关研究目的：通过观察神经肽SP与CGRP刺激SMSCs与神经化的SMSCs分泌炎性因子的能力,在炎性因子环境下的SMSCs与神经化的SMSCs中加入高分子量HA,评价炎性因子与神经肽之间的协同刺激作用,检测高分子量HA对神经肽SP、CGRP表达的抑制作用。方法：实验中采用组织块法分离、纯化培养人滑膜间充质干细胞,使用bFGF诱导SMSCs神经化,利用免疫细胞化学检测神经化的SMSCs与SMSCs中神经肽SP、CGRP的表达水平；使用神经肽SP与CGRP刺激SMSCs与神经化的SMSCs两种细胞,通过ELISA观察炎性因子IL-1β,IL-6与TNF-α在神经肽环境下的浓度依赖性与时间依赖性。利用IL-1β,IL-6与TNF-α建立一种体外炎性疼痛模式,观察在炎症环境下SMSCs与神经化的SMSCs两种细胞神经肽表达量的差异,并通过使用RT-PCR、Western blotting检测高分子量的HA在这种炎性环境下对神经肽SP、CGRP的抑制作用。结果：免疫细胞化学检测发现,神经化的SMSCs细胞胞浆与轴突内有明显的SP.CGRP阳性棕黄色染色,着色均匀；对照组中SMSCs细胞形态未发生改变,部分细胞胞浆淡染,未出现较长的神经样细胞轴突与轴突染色,使用Image-Pro Plus6.0半定量分析图片,实验组与对照组之间CGRP、SP的表达具有统计学差异；ELISA检测结果发现,神经化的SMSCs在神经肽SP与CGRP的刺激下IL-1β,IL-6与TNF-α的表达明显高于SMSCs组。在炎症环境下,神经化的SMSCs疼痛物质SP与CGRP在蛋白、基因水平的表达量明显高于SMSCs组,而高分子量的HA能够明显抑制神经化后的SMSCs神经肽SP与CGRP的表达。结论：通过使用bFGF诱导的人SMSCs(?)经化细胞具有表达神经肽SP、CGRP的能力；神经肽SP、CGRP与炎性因子IL-1β,IL-6与TNF-α能够相互作用于神经化的SMSCs,并体现出一种协同刺激作用。高分子量的HA可能参与了抑制神经化SMSCs分泌神经肽SP、CGRP的过程。