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强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性疾病,病变主要累及中轴关节和外周大关节。发病早期主要表现为炎症引起的下腰背疼痛和晨僵,随着病情进展,韧带组织出现异位骨化,并引起关节融合,最终导致残疾,严重影响患者的生活质量。异位骨化给患者带来严重影响,但其形成机制尚不明确。现有的研究发现,成纤维细胞在体外特定情况下显示出分化为成骨细胞的潜力,虽然其分化机制仍有待进一步探索,但这提示成纤维细胞可能是参与AS患者异位骨化的潜在细胞。四种转录因子(OCT4,SOX2,KLF4和MYC)将体细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS)的发现是干细胞研究领域的重大突破。这四种转录因子在维持细胞干性,去分化和再分化中起重要作用。有研究表明,一些化学物质的组合也可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞SOX2表达,从而转分化为多种体细胞谱系。TNF还可以通过NF-κB途径重新表达OCT4来使星形胶质细胞去分化,这表明重编程和炎症之间也存在关联。炎症是AS的另一大主要特点,目前AS的治疗策略主要是通过控制炎症来降低疾病活动度,从而缓解疾病进程。肿瘤坏死因子抑制剂(Tumor necrosis factor inhibitors,TNFi)被证明可有效缓解症状并降低疾病活动度,这是AS治疗史上一个重要的里程碑。此外最近研究还发现,迁移抑制因子(Migration inhibitory factor,MIF)和白细胞介素(Interluekin,IL)-22也可参与异位骨化形成。既然炎症参与了AS的发病过程,又可以调控干细胞转录因子的表达进一步参与细胞分化。那么干细胞转录因子是否可以作为联系AS早期炎症与晚期骨化之间的桥梁呢?本研究大胆地提出以下假说:在慢性炎症的刺激下,AS患者的韧带成纤维细胞通过高表达某种干细胞转录因子,发生细胞表型的改变,从而转分化为成骨细胞,参与异位骨化的发生。围绕此假说,本研究分以下三部分进行验证。第一部分:干细胞转录因子在AS异位骨化过程中的表达情况目的:通过检测体外骨化模型及AS和骨关节炎(Osteoarthritis,OA)患者韧带组织中的干细胞转录因子,筛选出可能参与成纤维细胞异位骨化的干细胞转录因子。方法:首先我们获取OA和AS患者髋关节置换手术的髋关节韧带标本,进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察其结构特点;然后将韧带组织中的原代成纤维细胞分离培养出来,利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和流式细胞术(Flow cytometry,FCM)进行细胞鉴定;在体外进行骨化诱导,利用干细胞转录因子芯片和实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)的方法验证骨化诱导过程中上调的转录因子;最后用qPCR的方法在韧带组织中进一步验证骨化模型中上调的转录因子。结果:分离培养出的原代细胞经鉴定99%为成纤维细胞,体外进行骨化诱导培养20天,使其成功转分化为成骨细胞,并发现在此过程中MYC与FOXO1表达上调(p<0.05);EGR1,ETS1,LEF和NANOG的表达量具有上调趋势;进一步在韧带组织中检测以上表达量上调的转录因子发现,MYC和EGR1在AS中的表达量较OA患者更高(p<0.05)。结论:干细胞转录因子MYC和EGR1可能参与了成纤维细胞向成骨细胞的转分化,从而参与AS韧带组织异位骨化的发生。第二部分:MYC和EGR1在骨化过程中的作用机制目的:进一步探究MYC和EGR1在AS异位骨化过程中的分子机制。方法:首先用慢病毒敲降成纤维细胞中的MYC和EGR1的表达并进行骨化诱导,qPCR的方法检测成纤维细胞骨化基因表达情况;ALP染色及矿化染色观察骨化程度的情况;再用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)-qPCR的方法检测转录因子下游靶基因。结果:原代成纤维细胞感染阴性对照(Negative control,NC)或MYC敲降(MYC-knock down,MYC-KD)慢病毒后进行骨化诱导。骨化诱导10天时,MYC-KD组较NC组的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)及骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达降低(p<0.05);骨化诱导20天时,MYC-KD组仅ALP表达较NC组降低(p<0.01),在培养板直接观察或者镜下观察均可见MYC-KD组的ALP显色深度较NC组显著降低;在明场及荧光镜下均可见,MYC-KD组的矿化结节明显较NC组减少;ChIP-qPCR结果显示,与IgG阴性对照相比,MYC可结合ALP与BMP2的启动子(p<0.05);说明MYC可通过调控ALP和BMP2的转录从而促进成骨。原代成纤维细胞感染NC或EGR1敲降(EGR1-knock down,EGR1-KD)慢病毒后进行骨化诱导。骨化诱导10天时,EGR1-KD组BMP2与Runt相关转录因子2(Runt Related Transcription Factor 2,RUNX2)表达量均较NC组上调(p<0.05);骨化诱导20天时,EGR1-KD组仅BMP2较NC组上调(p<0.01);在明场及荧光镜下可见,EGR1-KD组的矿化结节较NC组明显增多。敲降EGR1可促进骨化,说明EGR1本身具有抑制成骨的作用。接下来进一步探究了MYC和EGR1两者之间的关系。骨化诱导20天时,MYC-KD组EGR1的表达水平比NC组降低(p<0.01),提示EGR1可能是MYC下游基因,ChIP-qPCR定量结果显示,与IgG阴性对照相比,MYC可结合EGR1的启动子(p<0.05)。而EGR1-KD组相比较于NC组,MYC表达有升高趋势,差异无统计学意义。结论:成纤维细胞骨化过程中,MYC可直接调控ALP和BMP2的转录来促进成骨作用;EGR1是MYC下游靶基因,可以抑制BMP2和RUNX2的表达,从而阻碍成纤维细胞的骨化过程。第三部分:炎症对干细胞转录因子的影响目的:鉴于上述诱导骨化的实验均采用非体内的化学物质进行,本研究尝试使用重组人细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),IL-17,IL-23,IL-22和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)来模拟炎症反应的环境。进一步探索炎症与成纤维细胞MYC表达之间的关系。方法:重组细胞因子对原代成纤维细胞进行短期(24小时)或长期刺激(10或20天),qPCR检测干细胞转录因子及骨化标志性基因的表达情况;IHC的方法检测AS和OA患者韧带组织的炎症因子表达情况。结果:重组人源细胞因子(包括TNF-α,IL-17,IL-23,IL-22,IFN-γ)刺激原代成纤维细胞24小时后发现,TNF-α可抑制MYC表达(p<0.05),IFN-γ和IL-23可以促进MYC表达(p<0.05),同时我们还检测了ALP的表达水平,发现IL23和IFN-γ均可上调ALP表达(p<0.05)。因此继续用筛选出的IL-23和IFN-γ去长期刺激原代成纤维细胞。结果显示,IL-23长期刺激仅可上调ODM组ALP的表达(p<0.05)。IFN-γ刺激原代成纤维细胞后,MYC(p<0.01)和BMP2(p<0.05)的表达均上调。IHC结果显示,AS韧带组织中的IL-23和IFN-γ阳性细胞的数量均显著多于OA韧带组织(p<0.05)。结论:IL-23和IFN-γ一定程度上均可促进骨化基因的表达,由于IFN-γ在促进MYC的同时也可促进BMP2,因此提示IFN-γ有可能通过MYC-BMP2通路来促进骨化,IHC结果证实,AS韧带组织中的局部炎症也更加显著。通过三部分的研究,本研究的假说得到了证实:在慢性炎症刺激下(IFN-γ起主要作用),AS患者的韧带成纤维细胞高表达MYC,其进一步上调ALP和BMP2的表达,使成纤维细胞转分化为成骨细胞,参与异位骨化的发生。