论文部分内容阅读
酪氨酸脱羧酶(tyrosine decarboxylase,TDC)是一种依赖磷酸吡哆醛(PLP)的氨基酸脱羧酶,可以催化酪氨酸脱羧生成酪胺并释放出CO2。酪胺及其衍生物可以作为关键中间体合成医药、保健和化妆品等高附加值产品,其高效和绿色合成备受关注。应用TDC酶法生产酪胺是具有应用潜力的酪胺合成途径之一。然而TDC的催化机制和活性中心关键位点不明确,应用TDC酶法合成酪胺缺少理论支撑。针对上述问题,本论文对前期获得的重组短乳杆菌TDC进行硒代表达、纯化、蛋白结晶、X-射线衍射、结构解析及活性中心关键位点定点突变研究,主要研究内容及结果如下:首先,解析TDC的空间结构。对短乳杆菌来源的TDC进行了硒代重组表达与纯化,通过坐滴汽相扩散法获得了硒代蛋白晶体,并在日本同步辐射光源进行衍射数据收集,采用多波长反常散射法解决了相角问题,解析了TDC母体蛋白的空间结构(apo-TDC,1.73?,5HSI)。进一步,通过共晶法和分子置换法获得了TDC与PLP复合物的空间结构(holo-TDC,1.90?,5HSJ)。比较apo-与holo-TDC的结构发现,活性中心的K240和H241具有两种不同的构象:PLP与TDC结合后,K240与H241位置发生了偏转,H241的咪唑环旋转至PLP吡啶环的一侧。对K240和H241定点突变,结果显示K240A对酪氨酸和多巴的kcat/Km均降低,而H241位点仅在突变为Asn和Gln后保留部分活力且对两底物的亲和力显著降低。因此H241在辅酶、底物与酶的结合中发挥重要作用,而K240A可能通过影响H241的构象转变而导致催化效率降低。其次,活性中心关键位点的作用研究。将底物酪氨酸与holo-TDC分子对接,并对活性中心的位点进行了定点突变,研究活性中心关键位点对催化性能的影响。其中,E102、Y395、Y398、S586等位点突变成Ala后对催化活性影响显著。对E102和Y395位点进行半饱和突变,仅在突变为结构和性质相似的氨基酸(Asp和Phe)时保留67.9%和60.2%的活力,其余突变体活力降低至10%以下,它们可能通过盐桥和芳香堆积作用力参与了TDC活性中心空间构象的稳定。Y398A和Y398F突变体对酪氨酸的Km值分别为野生型的5.14倍和4.07倍,且kcat值都明显降低,表明Y398对底物的结合和催化都具有重要作用。S586突变为Ala后对酪氨酸的比活力是野生型的2.23倍(96.0 U·mg–1),kcat和Km分别为251 s–1和0.42 mmol·L–1,且催化效率kcat/Km是野生型的2.78倍(600L·s–1·mmol–1)。进一步对S586位点进行饱和突变,发现仅突变成Gly和Thr后保留大于10%的活力,其余突变体活力均小于5%或无可检测的活性。结合分子对接结果推测S586位点突变后催化效率与底物亲和力的提高是空间位阻降低和疏水性增加共同作用的结果。本论文为蛋白质工程提高TDC的催化效率及其在酪胺绿色生产中的应用提供了理论基础和实验依据。