论文Ⅰ脂联素受体在血管外膜及血管外膜成纤维细胞中表达的研究近年来的研究表明脂肪组织是高度活跃的内分泌器官,脂肪细胞分泌的产物称之为“脂肪因子”,主要包括:脂联素（adiponectin,APN）,瘦素（leptin）,抗素（resistin）,肿瘤坏死因子（TNFα）等。目前,在脂肪细胞因子的研究中,发现脂联素是体内最重要的保护性的脂肪因子,脂联素降低与糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化发生、发展密切相关。深入探讨脂联素的作用及机制,为防治代谢疾病及动脉粥样硬化的发生、发展具有重要的理论和临床意义。既往认为,血管外膜的功能是对血管起保护、支撑和营养作用。近年的研究发现,外膜还可以分泌多种血管活性物质,以旁分泌的方式调节血管的舒缩功能及结构变化。外膜中的主要细胞成分是成纤维细胞。外膜成纤维细胞具有旁分泌/自分泌功能,可分泌多种生物活性因子如生长因子（TGF-β1）、成纤维细胞生长因子（AB）、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、白介素-1、白介素-6、肿瘤坏死因子-α、MMP等,对动脉的结构和功能产生重要的调节作用。当发生来自血管内的损伤病变如血管扩张、内皮剥脱、高脂血症或来自血管外的损伤如外膜剥离、滋养血供受阻时,外膜中成纤维细胞增殖,细胞外基质产生增多,成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,进而引起组织修复和血管重塑。在损伤全过程中,外膜细胞增殖活性大于中层细胞,外膜成纤维细胞出现α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达,提示表型转化为肌成纤维细胞。虽然近年来国内外对脂联素的研究甚多,但是脂联素与血管外膜的关系尚未完全明了。脂联素的作用是通过脂联素受体Adipo R1和Adipo R2介导的。血管外膜及血管外膜成纤维细胞上是否存在脂联素受体,目前尚无相关报道。基于以上问题,构成了本研究的思路。本研究的目的:1探讨脂联素受体在血管外膜及血管外膜成纤维细胞上的表达情况;2在炎症状态下,血管外膜成纤维细胞表达脂联素受体的变化。通过这一研究,为进一步研究脂联素通过血管外膜发挥抗炎和抗动脉粥样硬化作用奠定基础。方法1细胞培养:剥脱小鼠胸主动脉的外膜,用组织贴块法进行原代细胞培养,当达到80-90融合时传代,实验采用第4-8代细胞。分别用α-SM-actin单抗（1:200）和波形蛋白（Vimentin）单抗（1:300）和二抗TRITC（1:100）进行免疫细胞荧光染色,鉴定所培养的细胞是否是所需要的AF及其纯度。2实验分组:（1）根据LPS的刺激浓度分组为了观察不同浓度梯度LPS刺激情况下血管外膜成纤维细胞脂联素受体的表达的变化,按照LPS的浓度分为5个组:1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,50μg/ml和PBS对照组。（2）根据LPS的不同刺激时间分组为了观察不同作用时间LPS刺激情况下血管外膜成纤维细胞脂联素受体的表达的变化,按照LPS 10μg/ml的不同刺激时间分为6个组:0hr,1hr,6hr,12hr,24hr,48hr。3 RT-PCR:观察正常血管外膜组织、骨骼肌组织及肝组织脂联素受体的表达及正常及LPS刺激后,血管外膜成纤维细胞（AFs）上AdipoR1及AdipoR2的表达,采用“2^-ΔΔCT方法”分析基因的表达量。4蛋白印迹分析:观察正常血管外膜组织、骨骼肌组织及肝组织脂联素受体的表达及正常及LPS刺激后,AFs上AdipoR1及AdipoR2的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。5免疫细胞荧光染色:观察正常及LPS刺激后,FITC和TRITC二抗标记的α-SM-actin、vimentin、AdipoR1及AdipoR2在AF中的表达,用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。结果1 AF的孵育和鉴定:组织贴块法培养血管外膜细胞,4-7d后有细胞从组织块边缘游出、贴壁生长。10%FBS的DMEM中培养7-10d后出现第一次细胞融合。当细胞出现80%-90%融合时,进行传代,第4-8代用于不同的试验.经免疫细胞荧光化学法显示所有培养细胞的。α-SM-actin单抗染色阴性,所有培养细胞的波形蛋白（Vimentin）单抗染色阳性,说明培养的AF纯度达到100%。2脂联素和脂联素受体的表达:AdipoR1在血管外膜组织及血管外膜成纤维细胞上mRNA和蛋白水平均高表达。与骨骼肌组织相比,脂联素受体1 mRNA在大鼠血管外膜组织中的表达约占85%（mRNA:血管外膜:10.79±8.84 vs骨骼肌:14.65±13.54;蛋白质:血管外膜:1.96±1.12 vs骨骼肌:1.69±0.82,P＞0.05）。AdipoR2在血管外膜组织及血管外膜成纤维细胞上mRNA和蛋白水平上均低表达。与肝组织相比约占5%（mRNA:血管外膜:5.72±3.90 vs肝脏:36.67±15.28;蛋白质:血管外膜:0.0059±0.0002 vs肝脏:0.6653±0.0270,P＜0.01）。没有检测到脂联素mRNA在血管外膜成纤维细胞上的表达。3 LPS刺激下脂联素受体1的表达:不同LPS浓度刺激下,AdipoR1的mRNA及蛋白质的表达在1μg/ml时略有升高（mRNA:1μg/ml:18.433±5.982 vs对照:20.030±3.313;蛋白质:1μg/ml:2.686±0.141 vs对照:2.637±0.256,P＞0.05）;5,10,50μg/mlLPS刺激时,AdipoR1的mRNA及蛋白质的表达逐渐降低,在50μg/ml浓度点时达最低谷（mRNA:50μg/ml:18.433±5.982 vs 0.013±0.001;蛋白质:50μg/ml:0.001±0.001 vs 2.637±0.256,P＜0.01）。在10μg/mlLPS刺激下,AdipoR1的mRNA在刺激1小时时表达略有升高（mRNA:1h:13.736±4.676 vs对照:10.793±5.102;P＞0.05）;6,12,24,48小时时,AdipoR1 mRNA的表达逐渐降低,在48小时时达最低值（mRNA:48h:0.063±0.044 vs对照:10.793±5.102,P＜0.01）。在1,6,12,24,48小时时,AdipoR1蛋白质表达逐渐降低,在48小时时达最低值（蛋白质:48h:6.990±0.150 vs对照:0.001±0.001,P＜0.01）。创新性及局限性1.创新点（1）应用RT-PCR、western blot及免疫细胞荧光等多种方法证实了血管外膜成纤维细胞上存在着脂联素受体,尤其是脂联素受体1,在国内外未见报道。（2）在LPS刺激下,血管外膜成纤维细胞脂联素受体1表达降低,呈时间和剂量依赖性。2.局限性（1）因技术所限,未能对脂联素受体进行进一步的功能研究。（2）未对脂联素受体在炎症刺激下表达降低的机制进行进一步的探讨。结论（1）正常血管外膜及血管外膜成纤维细胞可以表达脂联素受体,其中脂联素受体1高表达,脂联素受体2低表达,而血管外膜成纤维细胞几乎不表达脂联素。提示脂联素可能通过旁分泌途径作用于血管外膜成纤维细胞。（2）血管外膜成纤维细胞脂联素受体1的表达量与LPS刺激浓度和时间呈负相关。论文Ⅱ脂联素抑制脂多糖介导的血管外膜成纤维细胞增殖、迁移和肌化的研究背景越来越多的研究表明,脂联素能够减少脂质斑块的面积,抑制新生内膜的增厚及平滑肌细胞的增殖与迁移,抑制血管粘附分子的表达。通过这些作用,发挥抗动脉粥样硬化的效应。血管内皮损伤是动脉粥样硬化（atherosderosis,As）发病的始动因素,外膜一直被认为在AS的发生中只是一个旁观者。近期的研究得出了不同结论,发现动脉外膜炎症与AS的发生相关,在AS发生的早期外膜炎症即被激活,且炎症程度与血管病变的严重程度之间呈正相关,外膜套管、埋置内毒素浸泡的丝线等可诱导内膜增生性病变形成。这些研究结果提示血管外膜参与了内膜病变的形成,但机制尚不清楚。已知氧化应激是AS发生的主要机制之一,可由氧化酶活性升高和（或）抗氧化酶活性降低导致。氧化应激产物活性氧（reactive oxygen species,ROS）可通过两条途径参与As的发生发展:一是对血管细胞的直接损伤:另外可作为细胞内第二信使,诱导与AS发生相关的炎性细胞因子和粘附分子的表达,参与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖、迁移的调节。大量的一氧化氮与生物体内的氧气或超氧阴离子可迅速合成过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）,从而使NO形成强细胞毒性物质,启动氮氧化应激,造成细胞凋亡和组织损伤。定位于第17对常染色体上的Ⅱ型NOS称为诱导型（iNOS）,只在细胞受到炎性因子等刺激被激活后才明显表达。iNOS产生的大量的一氧化氮与生物体内的氧气或超氧阴离子可迅速合成过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）,从而使NO形成强细胞毒性物质,造成细胞凋亡和组织损伤。大量的研究已经表明脂蛋白过氧化和心血管内皮细胞膜受损是导致动脉粥样硬化的主要原因,而内皮细胞产生的ONOO-正是使脂蛋白过氧化和内皮细胞膜受损的主要物质。外膜成纤维细胞具有独立的NOS/NO系统,可生成NO。在正常情况下成纤维细胞iNOS低表达,生成少量的NO,但在受到细菌脂多糖（LPS）和细胞因子如TNF-α、IL-1β等刺激时,体外培养的血管成纤维细胞可强烈表达iNOs mRNA,iNOs蛋白合成及NO生成显著增加,表明血管外膜是血管壁NO的重要来源之一。虽然近年来国内外对脂联素的研究甚多,但是脂联素与血管外膜的关系尚未完全明了。血管外膜周围具有丰富的脂肪组织,这些组织可能分泌脂联素直接作用于邻近的血管外膜,局部分泌脂联素能否作用于血管外膜发挥抗动脉粥样硬化的作用、如何通过血管外膜对抗动脉粥样硬化的发生及发展,这些问题目前尚未完全明了。我们的前期研究表明,动脉粥样硬化病变血管内膜或外膜局部转染Ad-APN后,斑块的面积缩小,同时,血清脂联素浓度明显升高。脂联素可通过抑制血管壁黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用。但脂联素能否通过影响iNOS发挥作用及其机制尚不明了。基于以上问题,构成了本研究的思路。本研究目的:1探讨脂联素对LPS诱导的血管外膜成纤维细胞迁移、增殖及肌化的影响;2探讨脂联素对LPS诱导的血管外膜成纤维细胞iNOS、ONOO^-及NO的影响;3探讨脂联素发挥上述作用的可能信号转导通路。研究结果将为更深入地研究脂联素对血管的作用途径和作用机制奠定理论基础。方法1体内实验:1.1动物实验:90只10-12周龄的雄性apoE^-/-小鼠实验全程高脂饮食（含0.25%胆固醇和15%脂肪）喂养。实验动物随机分为3组:外膜局部转染脂联素腺病毒载体（Ad-APN）组,外膜局部转染绿色荧光蛋白腺病毒载体（Ad-GFP）组和生理盐水对照组,每组30只。全部实验鼠均于实验初行左颈总动脉套管（缩窄性硅胶管）术以诱发AS病变。外膜局部转染Ad-APN组于颈动脉套管手术4周后取出套管并外膜局部转染Ad-APN。外膜局部转染Ad-GFP组于颈动脉套管手术4周后取出套管并外膜局部转染Ad-GFP。对照组于颈动脉套管手术4周后取出套管并外膜局部转染生理盐水。1.2血清脂联素浓度分析:利用大鼠抗人脂联素ELISA试剂盒分析高脂饲料apoE^-/-小鼠转染腺病毒前后血清脂联素浓度。1.3 AS斑块的超声影像学形态特征:应用显微超声技术测量斑块面积。1.4生化指标检测:取实验前后全部动物眼球后采血,测定血脂浓度。1.5一氧化氮生成检测:取实验前后全部动物眼球后采血,测定血清中一氧化氮浓度。1.6病理学检测:颈动脉斑块组织学切片分别行苏木素一伊红染色,免疫组织化学染色观察iNOS和ONOO-的局部表达。2体外实验:2.1细胞培养:同论文Ⅰ。2.2实验分组2.2.1根据APN的刺激浓度分组为了观察不同作用时间及不同浓度梯度APN刺激情况下,血管外膜成纤维细胞功能的变化,按照APN的作用浓度分为4个组:3μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激组,10μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激组,30μg/ml APN+LPS 10μg/ml刺激组,无APN+LPS 10μg/ml对照组。根据APN不同作用时间分为6个组:LPS 10μg/ml对照组,APN刺激1/2小时组,APN刺激2小时组,APN刺激6小时组,APN刺激12小时组,APN刺激24小时组。2.2.2根据有无siRNA-AdipoR1转染及AMPK抑制剂分组为了观察APN和LPS对AF功能和相应信号转导通路上相关细胞因子表达的影响,按照有无siRNA-AdipoR1转染及AMPK抑制剂刺激将AF分为6个组:10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml组,siRNA-AdipoR1+10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml组,non-sensesiRNA+10μg/ml APN+LPS 10μg/ml对照组,Compound C+10μg/mlAPN+LPS 10μg/ml组,10μg/ml APN组和LPS 10μg/ml对照组。2.3 siRNA干扰AF AdipoR1蛋白表达的检测:western blot检测转染细胞β-actin,AdipoR1的蛋白质表达水平。2.4 MTT试验:观察APN和LPS刺激后,AF在不同时间点的增殖能力。2.5划痕法和transwell法:观察APN和LPS刺激后,AF在不同时间点的迁移能力。2.6一氧化氮生成检测:观察APN和LPS刺激后,AF生成一氧化氮的变化。2.7 RT-PCR:观察APN和LPS刺激后,iNOS和β-actin的表达,采用“2^-ΔΔCT方法”分析基因的表达量。2.8蛋白印迹分析:观察APN和LPS刺激后,iNOS、nitrotyrosine、p-AMPK、p-ACC和β-actin的表达。强弱用表达的蛋白和β-actin条带积分光密度的比值表示。2.9免疫细胞荧光染色:观察APN和LPS刺激后,FITC和TRITC二抗标记的α-SM-actin在AF中的表达,用IOD比较它们在不同分组间表达的强弱。结果1体内试验1.1动物的基本特征外膜局部转染Ad-APN组,外膜局部转染Ad-βgal组各有1只动物于首次左颈总动脉套管后死亡,其余动物全部完成实验。实验初动物各组间体重无明显差异。8周时,Ad-APN组小鼠体重较对照组及Ad-βgal组明显下降（27.35±1.26vs 31.44±1.24g;27.35±1.26 vs 30.75±1.21g,P均＜0.01）。1.2血清脂联素浓度ApoE敲基因小鼠高脂喂养8周后,血清脂联素明显降低（P＜0.01）。与转染前比较,外膜局部转染Ad-APN后,血清脂联素浓度增加约8倍（P＜0.01）。与外膜局部转染Ad-GFP比较,血管局部转染Ad-APN后,血清脂联素浓度增加约9倍（P＜0.01）。1.3 AS斑块影像学特征血管外膜转染Ad-APN与转染前相比,斑块面积明显缩小达26.72%（P＜0.01）,与外膜转染Ad-GFP相比斑块面积缩小24.53%（P＜0.01）。1.4脂联素对血脂的影响各组间套管前血清总胆固醇、甘油三酯、高密度胆固醇和低密度胆固醇浓度均没有统计学差异（P＞0.05）。与转染前比较,外膜局部转染Ad-APN后,血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度明显降低（P均＜0.01）,高密度脂蛋白浓度明显升高（P＜0.01）。与外膜局部转染Ad-GFP比较,外膜局部转染Ad-APN后,血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度明显降低（P均＜0.01）,高密度脂蛋白浓度明显升高（P＜0.01）。1.5脂联素对血清NO的影响与转染前和外膜局部转染Ad-GFP比较,NO浓度明显降低（P均＜0.01）。1.6脂联素对血管壁iNOS和ONOO-的影响与转染前和外膜局部转染Ad-GFP比较,iNOS和ONOO-的表达明显降低（P均＜0.01）。2体外实验2.1 AF的孵育和鉴定:同论文Ⅰ。2.2 siRNA干扰AF AdipoR1蛋白表达的效果应用不同浓度siRNA-AdipoR1转染AF进行RNAi,western blot检测AdipoR1的表达随转染浓度（50,100,200,250pmol/L）的增加逐渐减低（P均＜0.01）,而β-actin的表达不受影响。2.3 APN和LPS对AF增殖的影响（1）LPS对AF增殖的影响:通过MTT试验证实,与正常细胞对照组相比,LPS促进AF的增殖（P＜0.01）。（2）APN对AF增殖的影响:通过MIT试验进行OD值的比较,APN不影响正常AF细胞的增殖能力（P＞0.05）。与LPS组相比,APN+LPS组OD值下降（P＜0.01）。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组OD值升高（P均＜0.01）。2.4 APN和LPS对AF迁移的影响（1）LPS对AF迁移的影响:划痕实验显示随着LPS刺激时间的延长,LPS导致的AF的迁移能力逐渐增加。Transwell实验结果与划痕实验类似,随着LPS刺激时间的延长,穿过transwell膜的细胞数目逐渐增多。（2）APN对AF迁移的影响:与LPS组相比,APN+LPS组AF迁移距离和迁移细胞数减少（P＜0.01）。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组和CompoundC+APN+LPS组AF迁移距离和迁移细胞数增加（P均＜0.01）。2.5 APN和LPS对AF向MF转化的影响（1）LPS对AF向MF转化的影响:与正常细胞相比,LPS导致AFα-SM-actin单抗染色阳性的细胞数逐步增加（P＜0.01）。（2）APN对AF向MF转化的影响:与LPS组相比,APN+LPS组AFα-SM-actin单抗染色阳性的细胞数减少（P＜0.01）。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组AFα-SM-actin单抗染色阳性的细胞数增加（P均＜0.01）。2.6 APN和LPS对AF一氧化氮生成的影响（1）LPS对AF一氧化氮的影响:正常情况下,AF产生少量的一氧化氮;加入LPS刺激后,AF一氧化氮的产生增加（P＜0.01）。（2）APN对AF一氧化氮的影响:与LPS组相比,APN+LPS组AF产生的NO减少（P＜0.01）。在脂联素刺激浓度分别在3,10,30μg/ml时,一氧化氮的生成量以10μg/ml时降至最低;脂联素10μg/ml分别刺激1/2,1,2,6,12,24,48小时时,一氧化氮的生成量在2小时时达最低,而后随着APN作用时间的延长缓慢升高。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组AF产生的一氧化氮增加（P均＜0.01）。2.7 APN和LPS对AF iNOS和ONOO-表达的影响:与LPS组相比,APN+LPS组AFiNOS和ONOO-的表达降低（P均＜0.01）。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组.和Compound C+APN+LPS组AFiNOS和ONOO-的表达升高（P均＜0.01）。2.8 AF一氧化氮产生的信号转导通路通路的影响:与LPS组相比,APN+LPS组和APN组AF的p-AMPK和p-ACC的表达增加（P均＜0.01）。与APN+LPS组相比,siRNA-adipoR1+APN+LPS组和Compound C+APN+LPS组AF的p-AMPK和p-ACC的表达降低（P均＜0.01）。结论1血管外膜局部转染Ad-APN后血清血脂水平下降,体重减轻,说明脂联素可通过外膜局部干预发挥改善代谢的作用。2血管外膜局部转染Ad-APN后,血清过度增高的NO浓度明显下降,血管壁iNOS和ONOO-表达降低。提示脂联素可能通过抑制iNOS和ONOO-的表达来发挥外膜抗动脉粥样硬化作用。3体外实验证实,LPS对AF的迁移、增殖和肌化均有促进作用,而APN能够有效地抑制LPS对AF的迁移、增殖和肌化的促进作用。4体外实验证实LPS能够激活AF的iNOS,使NO和ONOO-产生增加,而APN能够抑制LPS对iNOS的影响。5体外实验证实,APN通过AdipoR1,激活AMPK通路,抑制iNOS的激活及NO和ONOO-的产生,抑制LPS造成的AF功能变化。