转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗抗寒功能验证及转录组学分析

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甘蔗(Saccharum spp.)是世界上最主要的糖料作物,广西是中国最大的甘蔗种植区。甘蔗喜热不耐冷,低温严重影响广西糖业的发展。α-微管蛋白(TUA)是构成微管的主要成分之一,SoTUA基因是编码甘蔗微管蛋白其中一个基因,其功能可以提高甘蔗的抗寒能力。本研究以转SoTUA基因甘蔗T2、T3代和野生型(WT)为试验材料,在人工气候室桶栽并进行模拟低温胁迫(4℃)和复温处理,检测其生理指标、SoTUA基因表达量;同时采用温室大棚种植,分别在甘蔗苗期、分蘖期、伸长期、成熟期测量农艺性状,筛选出抗性较强的转SoTUA甘蔗株系进行转录组测序,分析SoTUA在甘蔗抵御低温胁迫的作用和分子机理。主要研究结果如下:1、对获得的转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代甘蔗+1叶片进行30 mg·L-1除草剂浸泡筛选出六个转基因株系(L1、L2、L3、L4、L5、L6)。对其进行Bar基因扩增及测序,6个转基因株系均能扩增出阳性条带,Western blot实验证实转基因甘蔗SoTUA蛋白表达量大于非转基因甘蔗。2、对T2代甘蔗进行0、5、10 d的低温胁迫,T3代甘蔗进行低温0、3、6 d和复温2 d处理,检测+1叶进行抗氧化酶(SOD、POD)的活性、渗透调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白)、MDA含量和SoTUA基因表达量。相关性分析表明T2代甘蔗可溶性糖的含量与SoTUA基因的表达量呈正相关(p<0.05);隶属函数法综合评价T2代甘蔗抗寒能力强弱排序结果为L3>L2>L1>L5>L6>L4>WT,T3代甘蔗经低温处理后自我恢复能力强弱排序结果为L3>L1>L5>L2>WT,表明低温胁迫下转SoTUA甘蔗抗寒能力和恢复能力均强于非转基因甘蔗。3、对T3代6个转基因株系和非转基因甘蔗进行大田种植,测量甘蔗在幼苗期、分蘖期、伸长期、成熟期的农艺性状(SPAD、株高、茎径)和成熟期的锤度,结果显示虽然幼苗时期、分蘖期转基因甘蔗的株高显著低于野生型,但伸长期转基因甘蔗生长速率提高,到成熟期时部分转基因株系株高的还高于野生型;在成熟期大部分转基因甘蔗与野生型SPAD与茎径无显著差异;转基因甘蔗的锤度都显著高于非转基因甘蔗。4、对T3代转基因甘蔗L3株系与非转基因甘蔗进行0 d、3 d低温处理后进行转录组测序。结果表明:低温处理当天,共有差异表达基因52659个,其中显著上调11880个,下调15868个;筛选到与蔗糖代谢相关的差异基因160个,其中有105个上调表达,55个下调表达,GO富集于糖质子转运体活性;筛选出37个差异蔗糖转运蛋白(SUT),其中22个上调,15个下调。低温处理3 d共有差异表达基因86908个,其中显著上调15136个,显著下调31583个,上调差异基因GO富集在内质网内腔、ATP结合、蛋白质折叠、未折叠蛋白质结合、ADP结合,KEGG代谢通路富集在内质网蛋白加工、植物病原互作、糖基磷脂酰肌醇(GPI)合成等途径,表明低温3 d时转基因甘蔗抵御低温能力可能与内质网的蛋白加工修饰有关。筛选出与微管相关的差异表达基因94条,其中28个与MAP65/ASE1 family相关,10个与Dynamin family相关,8个与Dynamin central region相关,推测其低温下转SoTUA甘蔗能够调节MAP65/ASE1 family家族相关转录因子,提高微管阵列柔韧度,从而使得微管在低温下更稳定。对其相关抗逆转录因子的表达模式分析表明,MYB、b HLH、MADS、b ZIP家族可能参与转基因甘蔗响应低温胁迫。综上所述,SoTUA基因过表达能提高甘蔗抗寒能力、修复能力和成熟期的锤度,但不影响甘蔗正常的生长发育。转基因甘蔗有多种抗逆功能,在低温下通过调控相关MAP65/ASE1 family、MYB、bHLH等相关转录家族提高甘蔗抗寒能力。
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