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有机磷水解酶广泛用于生物降解有机磷农药残留和神经毒剂,对环境污染修复和保障人体健康具有重大意义。磷酸三酯酶OPH和甲基对硫磷水解酶MPH(亦称甲基对硫磷降解酶MPD)的研究较为深入。野生菌OPH和MPD降解有机磷农药或有机磷神经毒剂(如G类毒剂沙林、梭曼或模拟物氟磷酸二异丙酯DFP)活性很低,不能满足快速消毒要求。蛋白质工程构建有机磷神经毒剂高效降解酶和优化酶催化环境是提高磷酸三酯酶水解效率的主要途径,也是当前生物消毒技术的研究热点。P-F键属于难彻底水解的磷酯键,与G类神经毒剂产生生物学毒性有着直接关系。DFP是研究P-F键型有机磷毒剂水解机制的最佳模拟剂。本研究从有机磷农药降解菌中克隆了有机磷降解酶基因mpd和oph,构建了原核表达基因工程菌;定点突变成功构建了高效降解DFP的重组有机磷水解酶(rOPHm和rMPDm),并进一步研究了乙醇胺类介质对该酶的增效机制。主要结果如下:1、以施氏假单胞菌PseudomonasstutzeriHS-D36和黄杆菌Flavobacterium sp.ATCC 27551 基因组为模板,成功克隆到甲基对硫磷水解酶mpd基因和有机磷水解酶oph基因。oph基因全长1014 bp,编码337个氨基酸;mpd基因全长996 bp,编码331个氨基酸。成功构建了重组质粒pET-oph和pET-mpd,并在E.coli获得高效表达;SDS-PAGE电泳显示重组OPH和MPD分子量分别为37 KDa和36KDa;它们的最佳诱导条件分别为18℃、1.0mMIPTG和37℃、1.0mMIPTG。2、以野生型OPH(PDB:1dpm)和MPD(PDB:1p9e)为模板,对重组OPH和MPD进行同源模建。模型显示OPH和MPD同为同源二聚体,活性空腔均含有双核金属。OPH单体为(α—β)8折叠,双核金属为Zn2+。MPD单体含有一个β-lactamase,双核金属为一个Zn2+和一个Cd2+。酶活性中心的底物结合部位由三个疏水口袋组成:OPH离去基团口袋由W102、F103、F277和Y280组成;MPD离去基团口袋为F119、W179和F196残基构成。分子对接显示F103、L111、S72、A147等氨基酸是OPH催化水解DFP的必需基团,且F103是优化OPH催化功能的关键靶点。突变酶的F103Y和底物DFP(或过渡态)的对接值明显升高;Y103的酚羟基可以和DFP形成氢键,有利于DFP的水解。OPH和MPD的活性部位结构相似,推测相应位置的氨基酸残基也影响MPD的活性。采用反向PCR、重叠延伸PCR等基因工程技术,成功构建了 14种突变酶:6种rOPHm和8种rMPDm。这14种突变酶基因均在E.coli BL21中得到可溶性表达;突变为Tyr的突变体对DFP的水解活性都有不同程度的提高。结合分子建模信息,证明103位点是控制OPH催化活性的关键氨基酸残基;F119、W179和F196对MPD的活性有很大影响。3、亲和色谱分离纯化得到电泳纯重组OPH和MPD,进而分析乙醇胺类、胺类和醇类催化介质对rOPH和rMPD水解DFP/MP的影响。结果显示,乙醇胺类能增效OPH水解DFP,且作用效果三乙醇胺(TEA)>二乙醇胺(DEA)>乙醇胺(MEA)。增效剂介质中的酶促反应动力学符合米氏方程。TEA增效能力在0-400 mM范围内与增效剂浓度正相关。不同TEA浓度下的酶动力学均符合米氏方程,证明增效剂不改变rOPH和rMPD的米氏酶属性。乙醇胺类增效剂显著提高了DFP酶促水解的动力学参数kcat、Vm和kcat/Km。相比之下,胺类增效能力较弱;醇类没有明显增效作用。氟离子(DFP水解产物)抑制动力学分析证明:抑制剂(1-3mMNaF)降低rOPH与DFP的亲和力(Km升高)和抑制DFP酶促水解(kcat和Vm下降));加入TEA可以部分消除这种产物抑制效应。3 mMNaF导致rOPH活性下降约80%;添加300 mM TEA,rOPH动力学参数Vm和kcat/Km均提高到无抑制剂(对照)水平,分别为106.1 ± 1.1 μMmin-1和36.23 ± 5.07 mM-1 s-s。线性作图证明氟离子为线性混合型抑制剂;在0、100、200和300 mMTEA条件下Ki值分别为3.21、5.17、5.45和7.51 mM,证明TTEA增效动力学机制在于缓解氟离子产物抑制。重组OPH/MPD水解MP/PO的动力学参数Km、kcat、kcat/Km和Vm基本不变,说明乙醇胺对rOPH/rMPD水解MP/PO增效作用不明显,即乙醇胺类介质作用P-O键型的底物水解的效果不大;表明该类增效介质仅对P-F键具有专一性。TEA能够促进rOPHm/rMPDm水解DFP的效率,对突变为Tyr的突变体效果更强,而对突变为Ala的突变体效果很弱。进一步证明乙醇胺增效依赖于OPH/MPD活性中心控制产物释放的氨基酸残基。