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目的:在人肝癌Hep G2细胞中高表达PTPRO基因,观察其对人肝癌Hep G2细胞EMT现象的影响,并进一步了解EMT重要标志物,包括E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、β-catenin的表达情况变化。方法:(1)用浓度为100ng/m L的EGF(人表皮生长因子)持续作用于人肝癌Hep G2细胞36小时后,显微镜观察细胞形态是否发生间充质改变,以研究EGF是否能在体外诱导肝癌细胞发生EMT现象;(2)构建p EGFP-PTPRO及p EGFP-C2载体,通过PCR、基因测序证实载体构建成功;(3)分别用p EGFP-PTPRO及p EGFP-C2载体转染人肝癌Hep G2细胞,用倒置荧光显微镜观察荧光及Western-bolt检测PTPRO蛋白的表达验证是否转染成功;(4)实验共分为三组:空白组(加入等量转染试剂)、空载体组(转染p EGFP-C2质粒)、过表达组(转染p EGFP-PTPRO重组质粒)。各组转染质粒证实成功后,均加入浓度为100ng/m L EGF持续诱导,观察各组细胞的形态改变有无差异。(5)进行划痕愈合实验观察各组细胞迁移能力,验证各组发生EMT的能力差异。(6)Western-bolt法检测各组PTPRO、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、β-catenin蛋白表达水平的变化情况。(7)用激光共聚焦显微镜进一步观察各组细胞中β-catenin蛋白的分布及表达差异。结果:(1)用EGF处理Hep G2细胞36小时后在倒置荧光显微镜下观察,细胞出现明显的上皮间充质转化,发生EMT现象。(2)经基因测序及PCR证实PTPRO过表达载体(p EGFP-PTPRO载体)及对应空载体(p EGFP-C2载体)构建成功。(3)以人肝癌细胞Hep G2为研究对象,以p EGFP-PTPRO质粒及p EGFP-C2质粒进行转染。用荧光倒置显微镜观察,成功转染的细胞会显示绿色荧光,计算转染率大于70%后进行下一步验证。Western-bolt检测各组PTPRO蛋白变化,发现过表达载体转染组PTPRO蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.05);空白组、空载体转染组PTPRO蛋白表达无明显变化(p>0.05)。(4)转染成功后三组均加入EGF处理36小时,显微镜下观察发现PTPRO过表达组未发生明显上皮间充质改变,而空白组和空载体组细胞均发生明显上皮间充质改变。(5)划痕实验显示PTPRO过表达组转染后48小时细胞划痕无明显愈合,而转染空白质粒组及空白组细胞划痕均出现明显愈合。(6)Western Blot显示过表达组(转染p EGFP-PTPRO质粒)较空载体组(转染p EGFP-C2质粒)及空白组比较,E-cadherin蛋白的表达水平有所增高,Vimentin蛋白、N-cadherin蛋白的表达水平均有下降,差异均有统计学意义(p<0.05)。空载体与空白组比较,E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白及N-cadherin蛋白的表达差异均无统计学意义(p>0.05)。而β-catenin蛋白的表达水平三组间比较均无明显统计学差异。(7)激光共聚焦显微镜发现空白组、空载体组中的β-catenin主要分布于胞质中,而p EGFP-PTPRO组中的β-catenin却部分向核内转移。结论:PTPRO基因高表达可以抑制肝癌细胞EMT现象。