猕猴桃遗传多样性的SRAP分析及GPX和cAPX基因片段的克隆

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猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.)植物,在世界范围内分布广泛,我国是猕猴桃的主要产区之一。由于不同品种猕猴桃对生长环境的要求不同,因此研究不同品种间的遗传关系对合理规划各品种的种植区域具有重要意义。目前猕猴桃的研究大多集中在资源与育种、栽培与病虫害防治、生理与生化、贮藏与加工等方面,尚未见利用SRAP分子标记对猕猴桃进行遗传分析的研究报道。本文以猕猴桃叶片为供试材料,利用相关序列多态性(Sequence_related amplified polymorphism, SRAP)技术对24个猕猴桃品种进行遗传多样性的分析及品种鉴定。同时利用RT-PCR技术克隆了植物体内清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的两种过氧化酶——GPX和cAPX的基因片段。主要研究结果如下:1、利用均匀设计优化猕猴桃SRAP反应体系。建立了猕猴桃SRAP-PCR的最佳反应体系(25μL):Mg2+2.50mmol·L-1, dNTPs0.25mmol·L-1,引物0.2pmo1·L-1, Taq DNA聚合酶1.25U,模板DNA150ngo对扩增程序中的循环次数、退火温度进行筛选,获得的扩增程序为:94。C预变性5min;94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,53℃复性1min,72℃延伸1min,33个循环,72℃延伸10min。2、从100对引物组合中筛选出带型丰富、结果稳定、多态性较好的引物组合17对,对24份供试材料进行遗传多样性和亲缘关系分析,并统计分析扩增结果。扩增出条带总数为2462,其中多态性条带数为2199,多态性比率为89.32%。利用NTSYS软件对24份供试材料进行统计分析,得到遗传相似系数并用UPMGA法进行聚类分析。供试材料间的遗传相似系数为0.54~0.90,平均为0.72;野生猕猴桃中2号与其他品种间遗传差异显著,相似系数在0.58~0.69之间;美味猕猴桃品种间遗传相似系数在0.67~0.89之间,平均为0.78,彼此间遗传相似性较高。总体来讲,供试材料间的遗传基础较窄。UPMGA法聚类分析显示取遗传相似系数0.60时,可明显地将毛花猕猴桃与其他品种区分开;取相似系数0.73时,可将供试材料分为四类:分别为中华猕猴桃类、美味猕猴桃类、毛花猕猴桃和一个野生品种,体现出不同类群间的遗传差异。3、提取猕猴桃嫩叶RNA,根据保守区设计引物,利用RT-PCR得到362bp的编码谷胱甘肽过氧化物酶的cDNA片段和561bp的编码抗坏血酸过氧化物酶的cDNA片段。并在NCBI网站上对ORF及推导氨基酸序列等进行生物信息学分析。证明所得序列为目的片段,为后期获得基因全长奠定基础。
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