论文部分内容阅读
目的:建立不同产地蒙药材悬钩子木高效液相色谱（HPLC）的特征图谱并测定其主要成分（咖啡酸、表儿茶素和鞣花酸）的含量,用于不同产地悬钩子木的质量评价。从悬钩子木中提取、分离纯化多糖,分析其单糖组成并进行结构解析。研究悬钩子木多糖组分对小鼠脾淋巴细胞免疫调节功能的影响。本论文将与前期质量标准研究相补充,形成较完整的蒙药悬钩子木药效物质基础研究,以期阐明悬钩子木―促疫热成熟‖功效与现代生物医学中增强免疫功能活性的内在联系。方法:1)采用CAPCELL PAK MGII C18（4.6?250mm,5um）色谱柱,以乙腈（A）0.1%甲酸水溶液（B）为流动相,梯度洗脱（018min,10%A13%A;1833min,13%A20%A;3348min,20%A30%A;4878min,30%A85%A;7890min,85%A10%A）,流速1.0 mL?min-1,进样体积15μL,柱温30℃,紫外检测器检测波长254nm;采用中药色谱指纹图谱相似度评价（2012版）软件,对17批不同产地悬钩子木HPLC色图谱进行分析;采用SPSS 20.00版本软件对特征图谱共有峰的峰面积进行聚类分析;测定咖啡酸（324nm）、表儿茶素（280nm）、鞣花酸（254nm）的含量。2)采用热水浸提法提取悬钩子木粗多糖（Rubus sachalinensis polysaccharides,RSP）;以脱蛋白率和多糖损失率为评价指标,比较Sevage法、三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-Sevage法联用对蒙药悬钩子木多糖的脱蛋白效果;再经Cellulose DE-52纤维素离子交换柱、Sephadex G-100凝胶柱对其进行分离纯化;利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）鉴定纯度并测定分子量;采用气相色谱（GC）分析其单糖组成;采用红外光谱和核磁共振波谱对其结构进行初步解析。3)采用CCK-8法检测多糖组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;利用ELISA试剂盒测定多糖组分对IL-2、IFN-γ和TNF-α释放能力的影响。结果:1)建立了悬钩子木HPLC特征图谱共有模式,共标定11个共有峰。利用相似度软件对17批样品的HPLC色图谱进行分析,17批样品中有些样品的相似度差异较大,各批样品相似度在0.2860.972之间,对相似度>0.8批次的药材进行共有模式的建立及聚类分析,聚类分析将相似度>0.8批次的药材聚为2类。含量测定中咖啡酸、表儿茶素和鞣花酸线性范围分别为0.5402.700μg（r=0.9995）1.1225.610μg（r=0.9996）、0.0450.225μg（r=0.9998）,加样回收率分别在99.41%100.25%,95.69%99.09%,97.97%100.90%;平均加样回收率分别为99.56%,RSD 0.47%;96.83%,RSD 1.54%;99.66%,RSD 1.73%。2)悬钩子木粉末经水提醇沉法获得粗多糖,收率2.2%。木瓜蛋白酶-Sevage法联用脱蛋白效果最佳,最佳脱蛋白工艺为:酶用量0.40mg/mL、酶解温度62.46℃、酶解时间86.62min,经Sevage法脱蛋白2次;再经Cellulose DE-52纤维素离子交换柱分离得到RSP1、RSP2和RSP3。RSP1经Sephadex G-100色谱柱分离得到RSP1-1和RSP1-2分子量分布均一的2个多糖,分子量分别为13227Da（多分散指数1.15）和9343Da（多分散指数1.08）;2种多糖均主要含阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比分别是RSP1-1（9.5:7.0:10.3:18.6）和RSP1-2（5.7:11.1:10.3:14.2）;红外光谱及核磁共振波谱对其结构分析证明RSP1-1可能主要含有α-1,3-Ara,β-1,4-Gal,β-1,3-Glc,β-1,3-Man片段,RSP1-2可能主要含有β-1,4-Gal,β-1,3-Glc,β-1,3-Man片段。3)在浓度5200μg/mL时,RSP1-1、RSP1-2和RSP2均可刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖（P<0.05）,明显促进淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α（P<0.05）;在浓度为5μg/mL时RSP1-1、RSP1-2和RSP2均能促进淋巴细胞分泌IL-2（P<0.05）。结论:本论文与前期质量标准研究相互补充,形成较完整的蒙药悬钩子木药效物质基础研究,建立的悬钩子木HPLC特征图谱检测和定量测定分析方法可以有效地评价该药材的质量。RSP1-1和RSP1-2均为首次从悬钩子木中分离得到的天然来源的均一多糖。红外光谱及核磁波共振波谱进一步表征了其纯度和结构特征。RSP1-1、RSP1-2和RSP2三种多糖组分均能不同程度促进脾淋巴细胞的增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α,呈现一定的免疫调节活性。