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黑曲霉(Aspergillus niger)来源脯氨酰蛋白酶(prolyl endoprotease，PEP)是一种可以高效水解蛋白质或多肽脯氨酸残基羧基端肽键的蛋白酶。PEP可以用于提高啤酒澄清度、治疗乳糜泻疾病和降低蛋白水物苦涩味。国内还没有自主研发的PEP酶制剂产品，完全依赖进口。丝状真菌具有强大的分泌表达能力，广泛用于表达同源或者异源蛋白。黑曲霉作为基本安全(GRAS)微生物具有完整和高效的蛋白翻译后修饰，在表达同源或者异源蛋白时，具有安全、高产和高效的特点。本论文所用的表达宿主无孢黑曲霉SH-2，具有不产孢子、菌丝粗壮多分支和高产糖化酶的特点。首先发明了一种通过表型快速筛选高产PEP转化子的方法，同时通过PEG介导的原生质体转化的方法向无孢黑曲霉内转入了六种不同的PEP表达框。最后从六种不同的表达框中筛选出最优的PEP表达框。实验结果显示，六种表达框均成功转入无孢黑曲霉并且表达出PEP蛋白。六种不同的表达框转入无孢黑曲霉共产生283个PEP阳性转化子，通过发明的高通量筛选方法确定了含有糖化酶信号肽的PEP表达框的转化子具有最强的产酶能力。野生型无孢黑曲霉SH-2分泌表达的糖化酶、淀粉酶和蛋白酶总量达到30g/L，这些蛋白的大量表达不利于目的蛋白产量的提高及目的蛋白下游分离纯化和复配制剂。本论文通过敲除无孢黑曲霉SH-2的pyrG和kusA基因成功构建了一株可以连续高效敲除多个靶基因的菌株，为后续的进一步敲除多个大量表达的内源蛋白基因铺平道路。同时在经过pyrG和kusA基因敲除改造后的无孢黑曲霉SH-2中转入最优的PEP表达框。实验结果显示，PEP蛋白在经过pyrG和kusA基因敲除改造后的无孢黑曲霉菌株中高效表达。以此为基础，对经过pyrG和kusA基因敲除改造后PEP高产转化子进行5L发酵罐上罐发酵实验。5L发酵罐发酵上清的酶活为1.81nkat/ml，相对于帝斯曼（DSM）公司生产的经过浓缩的PEP酶制剂Brewer Clarex的酶活11.7nkat/ml而言，具有较大的应用潜力。