研究背景：血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)主要由脑血管内皮细胞与内皮细胞间紧密连接(Tight junctions)构成,对维持中枢神经系统内环境稳定起决定性作用,其中紧密连接则是维持BBB功能的最关键的结构之一。紧密连接在结构上是由一组蛋白分子元件所构成的复合体,主要由跨膜蛋白claudins蛋白家族、junction associated molecules (JAMs)蛋白家族、occludin蛋白及胞浆附属蛋白zonula occludens (ZOs)蛋白家族构成。细胞膜上跨膜紧密连接蛋白分子彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合,限制细胞旁物质转运。生理条件下,BBB内皮细胞中这些紧密连接蛋白分子的表达受到严格的调控。当由于各种原因,如外伤、感染、缺血缺氧、高热、肿瘤等,则可能通过多种途径导致BBB内皮细胞紧密连接分子元件的表达、修饰、组装异常进而直接导致BBB的结构、功能障碍。BBB的破坏是多种神经系统疾病脑损害和疾病发生、发展的重要原因。脑出血((?)tracerebral hemorrhage. ICH)是一种常见的脑血管疾病,占脑卒中总发病率的15-20%,是最严重的脑卒中类型,死亡率、致残率非常高。BBB的破坏是ICH发生后的一个普遍而重要的病理生理变化。目前认为,BBB破坏引起的血管源性脑水肿是ICH后脑水肿的主要类型。在ICH发生后,血肿周边脑组织存在BBB紧密连接超微结构的破坏。目前,脑出血后紧密连接异常改变及血脑屏障破坏的具体机制仍未完全清楚。而紧密连接是由一组不同的紧密链接蛋白分子所构成的复合体,因此阐明ICH后BBB内皮细胞各紧密连接蛋白分子的异常变化及其机制则是研究ICH等神经系统疾病发生、发展过程中脑组织损伤机制的关键之一。在紧密连接蛋白表达变化的分子机制研究方面,随着近年来紧密连接基础研究的深入,目前认为,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)的表达与活性变化可能是导致细胞紧密连接蛋白分子元件异常变化及BBB破坏的一个重要机制。MMPs是一类锌离子依赖性蛋白酶,可降解细胞外所有基质成分,主要参与细胞间基质内细胞信号转导、血管新生、炎症反应、细胞增殖及迁移、胚胎发育及损伤修复过程。研究表明,脑出血患者及ICH大鼠模型上可检测到MMPs表达增高,并且组织型基质金属蛋白酶抑制剂-2可减轻ICH大鼠模型的BBB破坏。近年有研究报道,在大鼠局部脑缺血模型中,BBB主要紧密连接蛋白claudin-5、occludin的表达水平均明显降低,随之出现大量的紧密连接蛋白降解产物。这一紧密连接蛋白的异常变化与组织中基质金属蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的表达水平与活性升高密切相关。当采用MMPs(?)抑制剂BB-1101治疗后,则可显著抑制紧密连接蛋白claudin-5、occludin的破坏过程。因此,本研究推测：ICH发生后,血肿及血肿分解产物等物质可能通过多种途径(尤其是MMPs通路)导致血肿周边脑组织BBB紧密连接蛋白的表达与分布异常,进而产生BBB结构破坏与脑水肿。目的：本研究通过采用脑内注射自体血制作大鼠ICH模型,检测不同时间点血肿周边脑组织MMP-2、9及相关BBB紧密连接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的表达变化,探究ICH后BBB紧密连接蛋白表达变化与BBB破坏的关系,并且进一步分析ICH后MMPs的表达与紧密连接蛋白表达改变的关系。实验方法：1、实验分组与ICH大鼠模型制作成年雄性Sprague Dawley大鼠128只,重量250～300g,随机分为对照组和ICH6h、12h、24h、48h、3d、7d、14d等8个组别,每组16只。左心室采集自体血后,立体定向穿刺右侧尾状核,注射75μ1非抗凝自体动脉血制作大鼠ICH模型。对照组采用正常大鼠。2、伊文思蓝通透性大鼠处死前按4ml/kg剂量经股静脉注射2%伊文思蓝生理盐水溶液,取脑组织进行称重,侵入2m150%三氯乙酸水溶液中进行匀浆,经高速离心后与无水酒精按1：3混合,接着在荧光分光光度计上测量伊文思蓝的荧光值,由标准曲线得到各脑组织伊文思蓝浓度,以每克脑组织的伊文思蓝含量(ug/g)来表示。3、石蜡组织包埋与切片各组大鼠经水合氯醛麻醉后,自左心室灌注冰冻生理盐水及4%多聚甲醛溶液固定。切取厚度约2mm的尾状核冠状断面脑组织,迅速投入4%多聚甲醛固定液中于4℃下固定2天。固定好的脑组织按照常规石蜡标本包埋方法进行制作石蜡标本,石蜡组织切片机切片,切片厚度5um。4、HE染色石蜡切片脱蜡水合后,经苏木素染色3min,1%伊红染色2min,中性树胶封片、晾干后在显微镜下观察、分析。5、免疫组化免疫组化检测ICH后MMP-2及MMP-9表达变化。石蜡切片抗原修复采用微波炉抗原热修复,抗原修复液为Tris-EDTA缓冲液(0.05M Tris-base,0.001M EDTA PH8.0),微波炉加热至煮沸后断电,反复一次,间隔15min。DAB显色,中性树胶封片、晾干后在显微镜下观察、分析。6、免疫荧光免疫荧光检测各组紧密连接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的分布与表达的变化。用鼠抗claudin-5与兔抗GFAP联合进行荧光双标实验及兔抗occludin、兔抗JAM-1进行免疫荧光单标实验。用激光共聚焦显微镜在高倍视野下拍摄血肿周边脑组织图片,分析微小血管上紧密连接蛋白表达变化。7、实时荧光定量PCR反应实时荧光定量PCR分析claudin-5、occludin、JAM-1表达变化。RNA提取纯化使用GeneJETTM RNA纯化试剂盒,逆转录合成cDNA采用Maxima(?)第一链cDNA合成试剂盒,具体步骤按照说明书操作。荧光定量PCR采用基于标准曲线的相对浓度定量的方法,SYBR Green荧光方案检测PCR扩增,使用ABIPRISM7500实时定量PCR仪进行分析。在荧光定量PCR反应中取不同梯度模板DNA标准品生成标准曲线,各样本的起始模板cDNA相对浓度由标准曲线上获得,经内参β-actin及对照组校准后以倍比表示。8、统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用ONE-WAY方差分析。方差齐性时多重比较用LSD-t检验；方差不齐时用Welch近似方差分析,多重比较用Dunnett T3检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。实验结果：1、各组脑组织伊文思蓝含量结果提示：与正常对照组相比,ICH后24h至7d脑组织伊文思蓝含量增高,差异有统计学意义(P<0.01),其中ICH后48h增高最明显,是正常对照组的2.23倍。2、通过HE染色观察不同组别脑组织病理改变来看,ICH后6h及12h未见到血肿周围区有明显脑组织疏松化；ICH后24h时血肿周围脑组织开始出现明显的水肿带；ICH48h：血肿周围水肿严重广泛,正常的神经细胞数目减少；ICH后3d血肿周围不但可见到明显的水肿带,其显著的特征是出现严重的炎症反应,可观察到大量白细胞渗出；ICH后7d可见血肿部分吸收,血肿周围有不太明显的水肿带及大量吞噬细胞；ICH后14d血肿周边水肿不明显,血肿未完全吸收,吸收后的血肿区见较多吞噬细胞及含铁血黄素沉积。3、免疫组化可观察到ICH后MMP-2及MMP-9可见明显增高。出血组自6h起血肿周围脑组织可见强阳性表达MMP-2的细胞,其形态提示为有突起的胶质细胞。ICH48h及3d血肿周边MMP-2阳性细胞更显著,可见血肿周围小血管被MMP-2阳性细胞围绕着,同时内皮细胞也表达不同程度的MMP-2。相应的,脑出血后MMP-9表达也明显增高。可观察到出血组6h～24h血肿边缘散在少数细胞阳性表达MMP-9,ICH后48h至7d可见到MMP-9表达明显增高,主要分布在白细胞及内皮细胞上。4、ICH后紧密连接蛋白claudin-5表达明显降低。共聚焦显微镜观察提示claudin-5呈线条状强烈表达于小血管上。与对照组比较,ICH组自6h起,claudin-5表达就出现降低,呈不连续及弱表达于内皮细胞间,48h及3d时其在血肿周围脑水肿区域表达最低,7d时稍有恢复,直到14d基本恢复正常表达水平。相应的实时荧光定量PCR结果显示,claudin-5mRNA表达在ICH后6h时出现迅速降低至最低水平,维持到7d逐渐恢复,直至14d仍低于正常水平,其差异具有统计学意义(P<0.01)。5、ICH后紧密连接蛋白occludin表达明显降低。共聚焦显微镜观察提示occludin形态与claudin-5一致。ICH后6h起occludin呈不连续及弱表达于内皮细胞间,48h及3d时其在血肿周围脑水肿区域表达最低,7d时逐渐恢复,于14d恢复至正常表达水平。相应的实时荧光定量PCR结果显示,occludin mRNA表达在6h至3d表达降低,其差异有统计学意义(P<0.01)。6、ICH后紧密连接蛋白JAM-1表达先明显降低,短期内迅速恢复后出现表达增高。共聚焦显微镜观察提示,正常脑内皮上JAM-1形态与claudin-5、occludin一致。与对照组比较来看,ICH组自12h起,内皮细胞间JAM-1表达开始出现降低,呈不连续或及弱表达于内皮细胞间,24h、48h时其在血肿周围脑水肿区域表达明显降低。但与claudin-5及occludin不同的是,血管上JAM-1于3d时基本恢复正常,其表达较其他时间点更强烈,并表达在一些炎性细胞上。7d及14d时血肿周围可见大量表达JAM-1的炎性细胞。相应的实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比较,ICH后12h至48hJAM-1mRNA表达水平出现降低,差异具有统计学意义(P<0.05),3d时差异无统计学意义,ICH后7d其表达水平出现增高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：1、ICH后可导致BBB破坏及继发性脑水肿发生,跨膜紧密连接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1表达降低及MMP-2、9表达增高与BBB破坏密切相关。2、在维持BBB通透性作用方面,claudin-5发挥着关键作用,occludin可能起到调节的作用,JAM-1与炎性细胞粘附渗出有关,而后者可通过表达MMPs进一步加重ICH后BBB破坏及脑水肿。3、ICH后MMPs等介导BBB内皮细胞紧密连接蛋白分子表达变化可能是ICH后BBB破坏及继发性脑水肿发生的重要分子病理基础。