Contraception on demand (即时避孕法),不同于传统的避孕药丸或各种宫内节育器等(IUD)避孕方法,是仅在需要时才采用的避孕方法,包括屏障类避孕方法(安全套等),事后避孕法,各种杀精子剂等。而各种杀精子剂因其除了能阻止妊娠,还可在一定程度上防止各种性传播疾病的扩散,并具有女性自主选择使用的优点,在15-25岁的青少年中尤为重要,是目前避孕方法研究的又一热点。比较理想的杀精子化合物应当集杀精子和抗各种微生物感染的作用于一体,且安全耐受,副作用轻微。但这只是理想目标,目前还不能要求某种化合物既有强有效的杀精作用,又有很好的抗病原微生物的作用,杀精子剂领域的研究也并不完全是找到一种上述两个效果兼得的药物,更重要的是找到更为有效的在数秒种内,有选择性的使100×106–200×106精子制动,而没有局部或全身反应,其高度特异性及有效性才是关键。以抑制精子运动为杀精子剂靶点符合避孕药物研究符合上述条件,是很有希望的研究方向。位于精子尾部中段(mid-piece)线粒体鞘经三羧酸循环(TCA)产生ATP是精子的常规活动(activated motility,或简称为Motility)的重要能量来源,并且是帮助精子穿过女性生殖道,到达输卵管的主要力量。因此作用于线粒体的化合物很可能是杀精子剂的重要候选成分。抗肿瘤药Lonidamine (LND)可作用于肿瘤细胞线粒体的膜通透转运孔(mitochondrial permeability transition (PT) pore,又称膜通透转运孔复合物,PTPC),引起肿瘤细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)降低,进而诱导肿瘤细胞细胞凋亡。LND曾被认为是一种较强的精子发生抑制剂,但因其强烈的肝、肾毒性而放弃其在抗生育领域的应用。AF-2364是Lonidamine的衍生物,功能类似,其毒副作用显著降低,37.5–50 mg/kg b.w.的AF-2364一周内给药2–5次强饲法即可有效在实验大鼠体内诱导出暂时可恢复的抗生育作用,目前被作为一种很有潜力的男性口服避孕药候选化合物。进一步的研究显示,AF-2364可干扰精子细胞与睾丸支持细胞间的黏着(AJ)连接,通过一系列信号传导通路,引起骨架蛋白(Actin)的聚集与解聚,使支持细胞与精子细胞间的黏附功能降低,可逆地诱导精母细胞及精子细胞从生精上皮丢失,导致给药大鼠不育。其他的相关研究多在此通路上的深入细化阐述,或以AF-2364诱导生殖细胞从生精上皮的丢失为体内模型,研究AF-2364作用后支持细胞与生精细胞间细胞连接的动力学改变。目前关于AF-2364抗生育作用的研究集中于睾丸当中,以精子细胞与睾丸支持细胞间连接为主,并未涉及其对于精子功能的影响;其次,研究以大鼠为主,也有有关家兔等其他物种的报道,暂时没有其对人类的直接影响。介于AF-2364与其类似物LND在其功能上的相似性,我们想了解AF-2364是否可以通过与LND作用于肿瘤细胞类似的机制影响人精子的线粒体PTPC,使线粒体功能下降,从而影响人类精子功能,进而在杀精子剂领域有一定的药用价值。本课题就此进行了一系列研究,探讨AF-2364作为一种杀精子剂的侯选成分的可能性,初步阐明其作用机制,并将结合相应的动物实验,将AF-2364制成阴道栓剂,观察其抗生育作用,评估其实际临床应用价值。体外实验发现,72μM的AF-2364可以显著抑制人精子的运动,精子的总活率及a级精子百分比在实验组及对照组间有显著性差异;并且在24μM,48μM,72μM,96μM的不同作用浓度下显示出剂量及时间倚赖性关系,可能可以发展为一种杀精子剂的侯选成分。进一步的研究发现,72μM AF-2364作用后线粒体ΔΨm显著下降,经流式细胞仪检测线粒体膜电位正常精子百分比较对照组显著降低,且阳性精子的平均电位强度也显著低于对照组;加用线粒体PT pore开放抑制剂环孢菌素(CsA)发现AF-2364对精子的制动作用可得到部分恢复;精子ATP荧光素酶检测实验发现72μM AF-2364作用后实验组精子ATP含量显著低于对照组,且精子的存活率在实验组与对照组间没有显著差异,而96μM AF-236472作用后15mins,精子存活率小于30%。上述结果提示72μM AF-2364可通过与Lonidamine相似的机制作用于线粒体膜PT pore,抑制线粒体能量代谢功能,使ATP产生下降,从而使精子制动。而在较高剂量时,AF-2364可能是触发了精子的凋亡程序,最终使精子死亡。我们同时检测了已经报道的AF-2364对细胞骨架一系列蛋白调控通路在人精子中的变化并对72μM AF-2364作用后15mins的人精子蛋白进行了蛋白质组学比对,未见显著差异;提示AF-2364作用后精子制动现象并不主要通过相关蛋白质表达或修饰水平的改变。在上述基础上,我们以BALB/c小鼠为模型,验证了AF-2364对小鼠精子的制动作用,并制备了AF-2364阴道凝胶进行了初步的交配实验,结果显示小鼠妊娠率下降。综上所述,本研究的意义在于:1)体外实验发现, AF-2364可以显著抑制人精子的运动,是一种杀精子剂的候选成分;2)对其精子制动的分子机制进行了研究,基本阐明其作用机理。AF-2364可通过与其类似物Lonidamine相似的机制作用于线粒体膜PT pore,抑制线粒体能量代谢功能,从而使精子制动;在较高剂量时,AF-2364可能触发了精子的凋亡程序,最终使精子死亡;3) AF-2364阴道Gel可以使BALB/c小鼠妊娠率下降,提示AF-2364可能可以发展阴道栓剂,具有一定的临床应用潜力;4)研究过程中建立并完善的精子JC-1染色结合流式细胞仪检测技术扩展了精子功能的分子诊断技术,结合本实验室现有基础,已经具备临床开展的条件。